Διερεύνηση της καρδιοπροστατευτικής δράσης και του υποκείμενου μηχανισμού δράσης βιοδραστικών συστατικών της ελιάς και του συνδυασμού τους σε in vivo πειραματικά μοντέλα μεταβολικού συνδρόμου

Abstract

Introduction: Clinical studies have previously established the role of olive products in cardiovascular disease (CVD) prevention, whilst the identification of the constituents or compound combinations responsible for the beneficial effects is still pending. Purpose: We sought to assess and compare the potential cardioprotective effects of oleuropein (OL), hydroxytyrosol (HT), oleocanthal (OC) and oleanolic acid (OA), regarding Ischemia/Reperfusion Injury (IRI) and CVD risk factors alleviation. According to the effects of each isolated compound on myocardial infarct size and MS parameters, we designed three combinational treatments with expected additive cardiovascular benefits. Our ultimate goal was the design of a potent and safe combinational therapy for high-cardiovascular-risk patients on a bench-to-bedside approach. Methods: Male C57Bl6 mice were randomized and received OL (20.6 mg/kg), HT (5.9 mg/kg), OC (11.6 mg/kg), OA (17.4 mg/kg) or vehicle (DMSO 5%) 6 weeks daily by oral gavage. At the end of week 6, all animals were subjected to 30min of myocardial ischemia followed by 2h reperfusion. The heart was excised and double stained for infarct size measurement. Next, we induced MS in C57Bl6 mice by feeding with western-type diet for 14 weeks. Mice were treated with one of the isolated compounds or vehicle for the last 6 weeks and IRI was induced at 14 weeks. At baseline, on weeks 8 and 14 we performed blood collection, weighing, fasting blood glucose determination, arterial blood pressure measurement and heart function was assessed by echocardiography. According to the observed effects, three combinational treatments (OL-HT-OA, OL-HT-OC and OL-HT-OC-OA) were investigated for their cardioprotective potential in the MS mouse model of IRI. The combinational treatment with the most favorable effects (OL-HT-OC) was further tested for potential antiatherosclerotic effects after 4-week administration in ApoE-/- mice and investigated for the underlying cardioprotective mechanism in C57Bl6 mice with MS by determining the expression of specific proteins in the ischemic myocardium. After ensuring safety of the combinational therapy OL-HT-OC in the selected and triple dose in healthy mice, we proceeded to evaluate the potential effects of OL-HT-OC supplement in patients with Chronic Coronary Artery Syndrome (CCAS). Cardiac function, inflammation markers and oxidative stress were assessed at baseline and after 4 weeks of treatment with the OL-HT-OC supplement. Results: We found that OL, OC and OA, but not HT, significantly reduced infarct size compared to vehicle-treated groups, in both healthy and MS-burdened mice. Diet- induced MS was established as the coexistence of elevated fasting blood glucose, total plasma cholesterol and body weight. OL exhibited antihyperglycemic properties by reducing fasting blood glucose and increasing insulin levels, while OA attenuated hypercholesterolemia. None of the bioactive compounds altered the increased body weight, nor the arterial pressure and echocardiographic parameters of myocardial function. OL-HT-OA, OL-HT-OC and OL-HT-OC-OA combinational treatments were cardioprotective, whereas only OL-HT-OC mitigated hyperglycemia. OL-HT-OC cardioprotection was attributed to apoptosis suppression and upregulation of antioxidant enzymes in the ischemic myocardium. Additionally, OL-HT-OC treatment reduced atherosclerotic plaque extent in vivo and low-density lipoprotein oxidation in vitro. No signs of toxicity were present after 4 weeks of administration in both tested doses. OL-HT-OC combinational treatment ameliorated cardiac, vascular and endothelial function in patients with CCAS. Conclusion: OL-HT-OC combinational therapy exerts potent cardioprotective, antihyperglycemic and antiatherosclerotic properties in vivo, with remarkable and clinically translatable cardiovascular benefits in high-risk patients. Our study provides valuable insight on the pleiotropic effects of olive products and the possible contradicting or synergistic effects that may arise in more complex mixtures, paving the way to leveraging their biological activities in clinical practice.

Εισαγωγή: Κλινικές μελέτες έχουν τεκμηριώσει το ρόλο των προϊόντων της ελιάς στην πρόληψη της καρδιαγγειακής νόσου (ΚΝ), ωστόσο ο προσδιορισμός των συστατικών ή των συνδυασμών τους που ευθύνονται για τις ευεργετικές επιδράσεις των προϊόντων της ελιάς δεν είναι ακόμα γνωστός. Σκοπός: Αρχικός μας στόχος ήταν να αξιολογήσουμε και να συγκρίνουμε τις πιθανές καρδιοπροστατευτικές επιδράσεις της ολευρωπαΐνης (OL), της υδροξυτυροσόλης (HT), της ολεοκανθάλης (OC) και του ολεανολικού οξέος (ΟΑ), στην προστασία από τη βλάβη μυοκαρδιακής ισχαιμίας/επαναιμάτωσης σε πειραματόζωα με μεταβολικό σύνδρομο. Σύμφωνα με τις επιδράσεις κάθε απομονωμένης βιοδραστικής ουσίας στο μέγεθος του εμφράγματος και στις παραμέτρους του μεταβολικού συνδρόμου (ΜΣ), σχεδιάσαμε τρεις συνδυαστικές θεραπείες με αναμενόμενα πρόσθετα καρδιαγγειακά οφέλη. Απώτερος στόχος μας ήταν ο σχεδιασμός μιας αποτελεσματικής και ασφαλούς συνδυαστικής θεραπείας για ασθενείς υψηλού καρδιαγγειακού κινδύνου, με μία προσέγγιση «από το εργαστήριο στην κλινική πράξη». Μέθοδοι: Αρσενικοί μύες C57Bl6 τυχαιοποιήθηκαν και έλαβαν OL (20,6 mg/kg), HT (5,9 mg/kg), OC (11,6 mg/kg), ΟΑ (17,4 mg/kg) ή τον φορέα (DMSO 5%) από του στόματος για 6 εβδομάδες ημερησίως. Στο τέλος της 6ης εβδομάδας, όλα τα ζώα υποβλήθηκαν σε 30 λεπτά μυοκαρδιακής ισχαιμίας ακολουθούμενη από 2 ώρες επαναιμάτωσης. Το μυοκάρδιο παραλήφθηκε για μέτρηση της έκτασης του εμφράγματος με διπλή χρώση. Στη συνέχεια, υγιείς μύες C57Bl6 έλαβαν διατροφή δυτικού τύπου για 14 εβδομάδες για την πρόκληση ΜΣ. Τα πειραματόζωα έλαβαν, επίσης, μία από τις απομονωμένες ενώσεις ή τον φορέα για τις τελευταίες 6 εβδομάδες και υποβλήθηκαν σε χειρουργείο επαγωγής μυοκαρδιακής ισχαιμίας/επαναιμάτωσης στο τέλος της 14ης εβδομάδας. Κατά την έναρξη του πρωτοκόλλου, την 8η και 14η εβδομάδα πραγματοποιήθηκε αιμοληψία, ζύγιση, προσδιορισμός γλυκόζης νηστείας, μέτρηση αρτηριακής πίεσης και αξιολόγηση της καρδιακής λειτουργίας με ηχωκαρδιογραφία. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, τρεις συνδυαστικές θεραπείες (OL-HT-OA, OL-HT-OC και OL-HT-OC-OA) διερευνήθηκαν για τις πιθανές καρδιοπροστατευτικές τους ιδιότητες στο μοντέλο μυοκαρδιακής ισχαιμίας/επαναιμάτωσης με ΜΣ. Η συνδυαστική θεραπεία με τις πιο ισχυρές ευεργετικές επιδράσεις (OL-HT-OC) δοκιμάστηκε περαιτέρω για την πιθανή αντιαθηροσκληρωτική της δράση μετά από 4 εβδομάδες χορήγησης σε μύες ApoE-/- και μελετήθηκε για τον υποκείμενο καρδιοπροστατευτικό μηχανισμό της σε ποντίκια C57Bl6 με ΜΣ, προσδιορίζοντας την έκφραση συγκεκριμένων πρωτεϊνών στο ισχαιμικό μυοκάρδιο. Αφού επιβεβαιώθηκε η ασφάλεια χορήγησης του μίγματος OL-HT-OC στην επιλεγμένη και σε τριπλάσια δόση σε υγιείς μύες, προχωρήσαμε στην αξιολόγηση των πιθανών επιδράσεων του συμπληρώματος OL-HT-OC σε ασθενείς με χρόνιο στεφανιαίο σύνδρομο. Η καρδιακή λειτουργία, οι δείκτες φλεγμονής και το οξειδωτικό στρες αξιολογήθηκαν κατά την έναρξη και μετά από 4 εβδομάδες λήψης του συμπληρώματος OL-HT-OC. Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η OL, η OC και το OA, αλλά όχι η HT, μείωσαν σημαντικά το μέγεθος του εμφράγματος σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, τόσο σε υγιείς όσο και σε μύες με ΜΣ. Η εγκατάσταση του διατροφικά επαγόμενου ΜΣ επιβεβαιώθηκε από τη συνύπαρξη αυξημένης γλυκόζης νηστείας, ολικής χοληστερόλης πλάσματος και σωματικού βάρους. Η OL εμφάνισε αντιϋπεργλυκαιμικές ιδιότητες μειώνοντας τη γλυκόζη νηστείας στο αίμα και αυξάνοντας τα επίπεδα ινσουλίνης, ενώ το ΟΑ ανέστειλε την επαγωγή της υπερχοληστερολαιμίας. Καμία από τις βιοδραστικές ενώσεις δεν επηρέασε το αυξημένο σωματικό βάρος, την αρτηριακή πίεση και τις ηχωκαρδιογραφικές παραμέτρους της μυοκαρδιακής λειτουργίας. Οι συνδυαστικές θεραπείες OL-HT-OA, OL-HT-OC και OL-HT-OC-OA εκδήλωσαν καρδιοπροστασία, ενώ μόνο η OL-HT-OC μετρίασε την υπεργλυκαιμία. Η καρδιοπροστασία της συνδυαστικής θεραπείας OL-HT-OC αποδόθηκε στην αναστολή της απόπτωσης και στην αυξορρύθμιση αντιοξειδωτικών ενζύμων στο ισχαιμικό μυοκάρδιο. Επιπλέον, η συνδυαστική θεραπεία OL-HT-OC μείωσε την έκταση της αθηρωματικής πλάκας in vivo και την οξείδωση της λιποπρωτεΐνης χαμηλής πυκνότητας in vitro. Δεν εντοπίστηκαν σημεία τοξικότητας μετά από 4 εβδομάδες χορήγησης και στις δύο δόσεις. Τέλος, η συνδυαστική θεραπεία OL-HT-OC βελτίωσε την καρδιακή, αγγειακή και ενδοθηλιακή λειτουργία σε ασθενείς με χρόνιο στεφανιαίο σύνδρομο. Συμπεράσματα: Η συνδυαστική θεραπεία OL-HT-OC εκδηλώνει ισχυρές καρδιοπροστατευτικές, αντιϋπεργλυκαιμικές και αντιαθηροσκληρωτικές ιδιότητες in vivo, με αξιοσημείωτα και κλινικά μεταφράσιμα καρδιαγγειακά οφέλη σε ασθενείς υψηλού κινδύνου. Η μελέτη μας παρέχει πολύτιμες πληροφορίες για τις πλειοτροπικές επιδράσεις των φυσικών προϊόντων και τις πιθανές αντικρουόμενες ή συνεργιστικές επιδράσεις που μπορεί να προκύψουν σε πιο σύνθετα μίγματα, ανοίγοντας το δρόμο για την αξιοποίηση των βιολογικών τους δράσεων στην κλινική πράξη.