Applications of genetic and genomic modifications (CRISPR / Cas9, ectopic expression) for the analysis of mechanisms of insecticide resistance

Abstract

Arthropod pests and disease vectors pose significant threats to agriculture, public health, and ecosystems globally. While chemical insecticides have traditionally served as a primary method for pest control, their widespread use has led to the development of resistance. Given the limited development of new compounds, understanding the genetic basis of this phenomenon is crucial in order to mitigate the failure of insecticide-based control methods. The research conducted during this PhD aimed to unravel the molecular mechanisms of resistance and their combined effects, employing an experimental approach that integrates gene-editing technologies, specifically CRISPR/Cas9, with sophisticated tools for genetic manipulation in the model organism Drosophila melanogaster. In the first sub-chapter, 3.1, the objective was to functionally validate several candidate mutations previously associated with target site resistance in important agricultural pests. In section 3.1.1, the impact of a substitution identified in the spider mite Panonychus citri at the PSST subunit of the respiratory complex I, the molecular target of METI-I acaricides, was examined. Toxicity bioassays with genome engineered fly lines harboring the A94V mutation did not reveal significant differences compared to control flies, suggesting the possible involvement of other loci in the observed resistance phenotype. Subsequently, the implications of a newly discovered mutation within the chitin synthase I gene of an etoxazole-resistant population of P. citri were examined. This mutation was postulated to potentially counteract the effects of the well-characterized I1017F mutation. However, toxicity bioassays in genome engineered flies showed that the simultaneous presence of both mutations did not alter the response of the flies to etoxazole compared to I1017F alone. In the final section of this sub-chapter, the aim was to investigate Bt toxin efficacy and resistance associated with mutated alleles of a Spodoptera frugiperda ABCC2 transporter. Initially, the SfABCC2 gene was expressed in transgenic Drosophila, rendering the flies susceptible to Bt toxins. Then, the contribution of certain mutations found on the ECL4 of the SfABCC2 transporter was assessed by integrating the mutated transporter genes into the Drosophila genome. Through toxicity bioassays with a Bt toxin mixture, the contribution of each mutation to resistance was validated. In the next sub-chapter, the focus was on another pivotal mechanism of insecticide resistance: enhanced detoxification, primarily mediated by P450 enzymes. Specifically, the potential of two Bactrocera oleae P450 enzymes previously observed in resistant field populations to confer resistance to pyrethroids was examined by heterologous expression of these genes in Drosophila. Despite enhanced expression of the P450s in transgenic flies, the results did not reveal significant tolerance against pyrethroids, apparently in contrast to earlier findings. In the final sub-chapter (3.3), a longstanding question regarding potential interactions among distinct resistance mechanisms was addressed. The use of CRISPR/Cas9 technology alongside tissue-specific expression of detoxification genes, enabled concurrent exploration of target site and metabolic resistance within a controlled background, with a focus on potential interactions. In section 3.3.1 the putative interactions between the two primary mechanisms of pyrethroid resistance, target site mutations and enhanced detoxification, were explored by generating transgenic flies expressing the P450 CYP6BQ23 in a L1014F kdr background. This work provided compelling evidence of synergistic interactions, as conferred by the almost multiplicative resistance ratios of the line bearing both mechanisms compared to control. Extending this approach in section 3.3.2, the outcome of similar interactions across different classes of pesticides was investigated. Specifically, the interplay between two mechanisms of abamectin resistance identified in Tetranychus urticae mites was examined. Genome-engineered Drosophila lines expressing the P450 CYP392A16 in a GluClI321T genetic background were generated and used in toxicity bioassays with abamectin. However, no significant difference in resistance ratios between the strain bearing both mechanisms and those with each individual mechanism was observed, suggesting alternative explanations regarding interactions of the underlying mechanisms. Overall, this thesis contributes to our understanding of insecticide resistance mechanisms and underscores the importance of integrative approaches in developing effective pest management strategies.

Τα αρθρόποδα που είναι εχθροί καλλιεργειών και φορείς ασθενειών αποτελούν σημαντικές απειλές για τη γεωργία, τη δημόσια υγεία και τα οικοσυστήματα παγκοσμίως. Παρότι τα παραδοσιακά χρησιμοποιούμενα χημικά εντομοκτόνα εξυπηρετούν ως πρωταρχική μέθοδος ελέγχου, η εκτεταμένη χρήση τους έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας. Δεδομένης της περιορισμένης ανάπτυξης νέων δραστικών ουσιών, η κατανόηση της γενετικής βάσης του φαινομένου της ανθεκτικότητας είναι κρίσιμη ώστε να μετριαστεί η αποτυχία των μεθόδων ελέγχου που βασίζονται στα εντομοκτόνα. Η έρευνα που πραγματοποιήθηκε κατά τη διάρκειατης παρούσας διατριβής στοχεύει να διαλευκάνει τους μοριακούς μηχανισμούς ανθεκτικότηταςκαι τα συνδυαστικά τους αποτελέσματα, χρησιμοποιώντας μια πειραματική προσέγγιση που ενσωματώνει τεχνολογίες γονιδιακής τροποποίησης, ειδικότερα CRISPR/Cas9, με εξειδικευμένα εργαλεία γενετικού χειρισμού στον οργανισμό-μοντέλο Drosophila melanogaster. Στο πρώτο υποκεφάλαιο (3.1), ο στόχος ήταν η λειτουργική αξιολόγηση ορισμένων υποψήφιων μεταλλαγών οι οποίες είχαν προηγουμένως συσχετιστεί με ανθεκτικότητα στόχου σε σημαντικούς εχθρούς καλλιεργειών. Στην ενότητα 3.1.1, εξετάστηκε η επίπτωση μιας αντικατάστασης που έχει ταυτοποιηθεί στο άκαρι Panonychus citri, στην υπομονάδα PSST του αναπνευστικού συμπλόκου I, το οποίο αποτελεί τον μοριακό στόχο των ακαρεοκτόνων METI-I. Οι βιοδοκιμές τοξικότητας με γονιδιωματικά τροποποιημένες σειρές μυγών που έφεραν τημεταλλαγή A94V δεν αποκάλυψαν σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με μύγες ελέγχου, υποδηλώνοντας την πιθανή εμπλοκή άλλων γενετικών τόπων στον παρατηρούμενο φαινότυπο ανθεκτικότητας. Στη συνέχεια, εξετάστηκαν οι συνέπειες μιας πρόσφατα ανακαλυφθείσας, σε έναν ανθεκτικό στο etoxazole πληθυσμό του P. citri, μεταλλαγής στο γονίδιο της συνθάσης της χιτίνης Ι. Η μεταλλαγή αυτή θεωρήθηκε ότι δυνητικά εξισορροπεί την επίδραση της καλά χαρακτηρισμένης μεταλλαγής I1017F. Ωστόσο, οι βιοδοκιμές τοξικότητας σε γονιδιωματικά τροποποιημένες μύγες έδειξαν ότι η ταυτόχρονη παρουσία και των δύο μεταλλαγών δεν μετέβαλε την απόκριση των μυγών στο etoxazole σε σύγκριση με μόνη την I1017F. Στην τελευταία ενότητα του υποκεφαλαίου αυτού, ο στόχος ήταν να διερευνηθεί η δραστικότητα της τοξίνης Bt και η ανθεκτικότητα που συσχετίζεται με μεταλλαγμένα αλληλόμορφα ενός μεταφορέα ABCC2 της Spodoptera frugiperda. Αρχικά, το γονίδιο SfABCC2 εκφράστηκε σε διαγονιδιακές Drosophila, καθιστώντας τις μύγες ευαίσθητες στις τοξίνες Bt. Ακολούθως, εκτιμήθηκε η συμβολή συγκεκριμένων μεταλλαγών που έχουν βρεθεί στο ECL4 του μεταφορέα SfABCC2 με ενσωμάτωση των μεταλλαγμένων γονιδίων του μεταφορέα στο γονιδίωμα της Drosophila. Μέσω βιοδοκιμών τοξικότητας με ένα μίγμα τοξινών Bt, αξιολογήθηκε η συμβολή κάθε μεταλλαγής στην ανθεκτικότητα. Στο επόμενο υποκεφάλαιο, το επίκεντρο ήταν σε έναν άλλο ζωτικό μηχανισμόανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα: την ενισχυμένη αποτοξικοποίηση, πρωταρχικά διαμεσολαβούμενη μέσω των ενζύμων P450. Ειδικότερα, εξετάστηκε η ικανότητα δύο ενζύμων P450 του δάκου Bactrocera oleae που είχαν προηγουμένως παρατηρηθεί σε ανθεκτικούς φυσικούς πληθυσμούς, να επάγουν ανθεκτικότητα σε πυρευροειδή μέσω ετερόλογης έκφρασης των γονιδίων αυτών στην Drosophila. Παρά την αυξημένη έκφραση των P450s σε διαγονιδιακές μύγες, τα αποτελέσματα δεν έδειξαν σημαντική ανοχή έναντι πυρεθροειδών, κατ’ αρχάς σε αντίθεση με προγενέστερα ευρήματα. Στο τελευταίο υποκεφάλαιο (3.3), διερευνήθηκε ένα μακροχρόνιο ερώτημα που αφορά τις δυνητικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ διακριτών μηχανισμών ανθεκτικότητας. Η εφαρμογή της τεχνολογίας CRISPR/Cas9 παράλληλα με την ιστοειδική έκφραση γονιδίων ανθεκτικότητας, επέτρεψε την ταυτόχρονη διερεύνηση τόσο της ανθεκτικότητας στόχου όσο και της αποτοξικοποίησης στο πλαίσιο ενός ελεγχόμενου γενετικού υποβάθρου, με επίκεντρο τις δυνητικές αλληλεπιδράσεις τους. Στην ενότητα 3.3.1 οι ενδεχόμενες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δύο κύριων μηχανισμών ανθεκτικότητας σε πυρεθροειδή, μεταλλαγών ανθεκτικότητας στόχου και ενισχυμένης αποτοξικοποίησης, διερευνήθηκαν μέσω της κατασκευής διαγονιδιακών μυγών που εκφράζουν την P450 CYP6BQ23 σε γενετικό υπόβαθρο L1014F kdr. Η δουλειά αυτή παρείχε ισχυρές ενδείξεις συνεργιστικών αλληλεπιδράσεων, όπως προκύπτει από τους σχεδόν πολλαπλασιαστικούς λόγους ανθεκτικότητας της σειρά που φέρει και τους δύο μηχανισμούς σε σχέση με τις σειρές ελέγχου. Επεκτείνοντας αυτή την προσέγγιση στην ενότητα 3.3.2, διερευνήθηκε το αποτέλεσμα παρόμοιων αλληλεπιδράσεων σε διαφορετικές τάξεις εντομοκτόνων. Συγκεκριμένα, εξετάστηκε η αλληλεπίδραση μεταξύ δύο μηχανισμών ανθεκτικότητας σε αμπαμεκτίνη στο άκαρι Tetranychus urticae. Κατασκευάστηκαν γονιδιωματικά τροποποιημένες σειρές Drosophila που εκφράζουν την P450 CYP392A16 σε γενετικό υπόβαθρο GluCl I321T και χρησιμοποιήθηκαν σε βιοδοκιμές τοξικότητας με αμπαμεκτίνη. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στους λόγους ανθεκτικότητας μεταξύ του στελέχους που φέρει και τους δύο μηχανισμούς και αυτών που φέρουν τον καθένα μόνο του, πράγμα που υποδηλώνει εναλλακτικές ερμηνείες ως προς τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των υποκείμενων μηχανισμών. Συνολικά, η παρούσα διατριβή συμβάλλει στην κατανόηση των μηχανισμών ανθεκτικότητας και τονίζει τη σημασία των ολοκληρωμένων προσεγγίσεων στην ανάπτυξη αποτελεσματικών στρατηγικών διαχείρισης επιβλαβών αρθροπόδων.