Διερεύνηση του ιού των παραμορφωμένων πτερύγων (DWV) στην κυψέλη και συσχέτιση με το άκαρι Βαρρόα

Abstract

The Varroa destructor mite is an external parasite that causes significant losses in bee colonies. It acts as a carrier for numerous viruses, the most important of which is the Deformed Wing Virus (DWV), found almost worldwide. The relationship between the two pathogens is mutually beneficial. The mites not only weaken the bees but also facilitate the spread and proliferation of the virus within the colonies. Like most viruses, DWV is present in seemingly healthy colonies as a latent infection. However, under the influence of various biotic and abiotic factors, it can turn into a symptomatic infection. The synergistic action of Varroa and the virus exacerbates the challenges faced by bees and consequently beekeepers, who strive to maintain the health of their colonies. The spread and viral load are also related to colony dynamics, particularly the brood rearing cycles throughout the year. The complexity of the colony as a superorganism and the biology of DWV itself should be considered during sampling. In this research, trials were conducted to determine a representative sampling for assessing DWV load at the colony level, as no systematic methodology had been previously recorded. Additionally, the study investigated the impact of different storage conditions on the quality of genetic material in samples and the quantification of DWV using real-time PCR, in order to examine if common sample management methods used by beekeepers could be employed for the accurate detection of viral diseases. According to our findings, any of the tested sampling methods (20 bees from side or central frames, 10 bees from each frame) can be used to quantify the virus at the colony level. However, collecting 50 bees per each frame is not recommended due to the large sample size. Regarding storage conditions, immediate preservation of the sample at extremely low temperatures is undeniably the ideal method for molecular analyses. However, if this is not possible, analysis can still be performed with some deviations. As for storage conditions, immediate preservation of the sample at extremely low temperatures is undoubtedly the best method for molecular analyses. However, if this is not feasible, analysis can still be carried out, with the anticipated discrepancies. To better understand the nature of the DWV and Varroa interaction, the virus load was monitored alongside Varroa load after treatment with oxalic acid and amitraz over a year period. This study highlighted the complexity of the DWV-Varroa dynamics and its seasonal variation. Timely and effective mite treatment can temporarily prevent colony collapse during winter, but the viral infection can persist for a long time, emphasizing the importance of alternative virus transmission routes and the risk of future losses. It also appears that controlling Varroa at the end of the season is not sufficient to prevent the irreversible high viral load. Aiming for a multifaceted investigation of the pathogens' relationship, the viral load and Varroa infestation were determined in both adult bees and brood. The results suggested that the relationship between DWV and Varroa is more evident in the brood stage, indicating the influence of Varroa infestation on the progression of viral infection within the colony. In studying the impact of DWV on the developmental stages of the bee after artificial inoculation with high and low concentrations of viral copies, it was observed that the severity of visual deformities in larvae, mortality, and subsequent increase in viral load were related to the initial viral load. This underscores the importance of maintaining the virus at levels safe for proper brood development and colony survival. Since the cause of visible deformity symptoms in only a percentage of DWV-infected bees remains unclear, the study also explored the relationship between certain morphometric characteristics of seemingly healthy and affected bees and the viral load levels. Significant differences were noted between symptomatic and asymptomatic bees regarding body mass and abdominal dimensions. However, our findings highlighting that elevated levels of DWV do not consistently lead to the development of a specific phenotype, while the viral load in deformed and non-deformed individuals does not necessarily differ. The investigation of DWV spread and its association with Varroa infestation, both before and after treatment with different miticides, demonstrated the widespread presence of the virus in Greece, its high detection rate in colonies, and its persistence even after successful Varroa treatment.

Το άκαρι Varroa destructor είναι ένα εκτοπαράσιτο που οδηγεί σε σημαντικές απώλειες μελισσιών. Αποτελεί φορέα πληθώρας ιών, ο σημαντικότερος εκ των οποίων είναι ο ιός των παραμορφωμένων πτερύγων (Deformed Wing Virus - DWV), που απαντάται σχεδόν παγκοσμίως. Η σχέση των δύο παθογόνων είναι συμβιωτική. Τα ακάρεα δεν αποδυναμώνουν απλώς τις μέλισσες, αλλά διευκολύνουν τη διάδοση και τον πολλαπλασιασμό του εντός των αποικιών. Όπως οι περισσότεροι ιοί, ο DWV απαντάται σε φαινομενικά υγιή μελίσσια με τη μορφή αφανούς μόλυνσης. Ωστόσο, υπό την επίδραση ποικίλων βιοτικών και αβιοτικών παραγόντων, μπορεί να μετατραπεί σε συμπτωματική πλέον μόλυνση. Η συνεργιστική δράση βαρρόα και ιού επιδεινώνει τις προκλήσεις που αντιμετωπίζουν οι μέλισσες και κατ’ επέκταση οι μελισσοκόμοι, προκειμένου να διατηρήσουν την κατάσταση υγιεινής των μελισσοσμηνών τους. Η διασπορά και το φορτίο των ιών σχετίζονται επιπλέον με τη δυναμική των μελισσιών και ιδιαίτερα με τους κύκλους εκτροφής του γόνου στη διάρκεια του έτους, ενώ η πολυπλοκότητα του μελισσιού και η βιολογία του ίδιου DWV θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την δειγματοληψία. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, εξετάστηκε αρχικά ο καθορισμός αντιπροσωπευτικού δείγματος, με σκοπό τον προσδιορισμό του φορτίου του DWV σε επίπεδο μελισσιού, καθώς συστηματική μεθοδολογία δεν είχε προηγουμένως καταγραφεί. Μελετήθηκε επίσης η επίδραση διαφορετικών συνθηκών αποθήκευσης στην ποιότητα του γενετικού υλικού των δειγμάτων και την ποσοτικοποίηση του DWV με τη χρήση PCR πραγματικού χρόνου, ώστε να ελεγχθεί αν οι κοινές μέθοδοι διαχείρισης των δειγμάτων από τους μελισσοκόμους επηρεάζουν τη μεθοδολογία ανίχνευσης των ιογενών ασθενειών. Από τα αποτελέσματα της αρχικής αυτής φάσης προέκυψε το συμπέρασμα πως κάθε μια από τις δειγματοληψίες μελισσών που δοκιμάστηκαν (20 μέλισσες από ακραία ή κεντρικά πλαίσια, 10 μέλισσες από κάθε πλαίσιο), δύναται να χρησιμοποιηθεί για την ποσοτικοποίηση του ιού σε επίπεδο μελισσιού. Η συλλογή 50 μελισσών/πλαίσιο ωστόσο δεν συστήνεται, λόγω του μεγάλου μεγέθους του δείγματος. Όσον αφορά τις συνθήκες αποθήκευσης, η άμεση διατήρηση του δείγματος σε εξαιρετικά χαμηλές θερμοκρασίες (<-20o C) αποτελεί την ιδανικότερη μέθοδο για μοριακές αναλύσεις. Ωστόσο, στις περιπτώσεις όπου η χρήση υγρού αζώτου ή χαμηλών θερμοκρασιών κρίνεται πρακτικά αδύνατη, όπως κατά τη συλλογή και αποστολή δειγμάτων από μελισσοκόμους, η ανάλυση μπορεί να πραγματοποιηθεί με τις συνεπαγόμενες αποκλίσεις. Με σκοπό να γίνει περισσότερο σαφής η φύση της αλληλεπίδρασης DWV και βαρρόα διερευνήθηκε η μεταβολή του φορτίου του ιού παράλληλα με εκείνο της βαρρόα, μετά την καταπολέμηση με οξαλικό οξύ και αμιτράζη, για διάστημα μεγαλύτερο του ενός έτους. Η μελέτη αυτή ανέδειξε την πολυπλοκότητα της δυναμικής DWV – βαρρόα και τη διαφοροποίηση της κάθε εποχή. Η έγκαιρη και αποτελεσματική ακαρεοκτόνος θεραπεία μπορεί να οδηγήσει στην προσωρινή αποφυγή της κατάρρευσης των μελισσιών το χειμώνα, όμως η ιογενής μόλυνση μπορεί να παραμείνει για μεγάλο χρονικό διάστημα, τονίζοντας τη σημασία των εναλλακτικών οδών μετάδοσης του ιού και τον κίνδυνο για μεταγενέστερες απώλειες. Φαίνεται επίσης πως η καταπολέμηση της βαρρόα στο τέλος της σεζόν δεν αρκεί για την αποφυγή του μη αναστρέψιμου υψηλού ιικού φορτίου. Έχοντας ως στόχο την πολυδιάστατη διερεύνηση της σχέσης των εν λόγω παθογόνων, το ιικό φορτίο και ο βαθμός προσβολής από βαρρόα προσδιορίστηκαν τόσο σε ενήλικες μέλισσες όσο και στο γόνο. Βάσει των ευρημάτων της παρούσας μελέτης γίνεται διακριτό πως η σχέση DWV-βαρρόα σε μια συγκεκριμένη χρονική στιγμή αντικατοπτρίζεται πιο ξεκάθαρα στο στάδιο του γόνου, υποδεικνύοντας της επίδραση του φορτίου βαρρόα στην εξέλιξη της ιογενούς λοίμωξης στο μελίσσι. Κατά τη μελέτη της επίδρασης του DWV στα εξελικτικά στάδια της μέλισσας, μετά από τεχνητή επιμόλυνση μέσω έγχυσης με ένα διαλύματα υψηλής και ένα χαμηλής συγκέντρωσης ιικών αντιγράφων, παρατηρήθηκε πως η ένταση των οπτικών αλλοιώσεων στις νύμφες, η θνησιμότητα και η επερχόμενη αύξηση του ιικού τίτλου, σχετίζονται με το φορτίο με το οποίο επιμολύνθηκαν, επισημαίνοντας τη σημασία της διατήρησης του ιού σε ασφαλή για την σωστή ανάπτυξη του γόνου και την επιβίωση του μελισσοσμήνους επίπεδα. Δεδομένου ότι η αιτία που οδηγεί στην εμφάνιση ορατών συμπτωμάτων παραμόρφωσης μόνο σε ένα ποσοστό προσβεβλημένων από τον DWV μελισσών παραμένει μέχρι και σήμερα αδιευκρίνιστη, κρίθηκε καίριο να διερευνηθεί η σχέση μορφολογικών χαρακτηριστικών φαινομενικά υγιών και παραμορφωμέμων μελισσών με τα επίπεδα του ιικού φορτίου. Έντονες διαφορές καταγράφηκαν μεταξύ συμπτωματικών και μη μελισσών όσον αφορά τη μάζα σώματος και τις διαστάσεις τις κοιλιάς. Υποδεικνύεται επίσης, πως υψηλά επίπεδα DWV δεν συνεπάγονται πάντα και εμφάνιση του συγκεκριμένου φαινοτύπου, ενώ το ιικό φορτίο παραμορφωμένων και μη ατόμων δεν διαφέρει απαραίτητα. Ωστόσο, φαίνεται πως οι μέλισσες με έντονα εκφρασμένο τον φαινότυπο της παραμόρφωσης φέρουν υψηλότερο φορτίο DWV συγκριτικά με τις ασυμπτωματικές, καθώς και τις ηπιότερα παραμορφωμένες. Tέλος, δείγματα μελισσών από διαφορετικές περιοχές και μετά από θεραπεία με ποικίλα ακαρεοκτόνα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με σκοπό τη συσχέτισή των επιπέδων του ιού με το βαθμό προσβολής από βαρρόα, όπου αποτυπώθηκε η μεγάλη εξάπλωση και υψηλή συχνότητα ανίχνευσης του ιού στη χώρα μας, ενώ επισημάνθηκε η αδυναμία εξάλειψής του ακόμα και μετά από επιτυχημένη θεραπεία για τη βαρρόα.