Πρωτεΐνες του μηχανισμού της RNA σίγησης και ο ρόλος τους στο βιολογικό κύκλο του ιοειδούς PSTVd

Abstract

Viroids are small, naked, circular, non-coding RNAs that infect many plant species. Potato Spindle Tuber Viroid (PSTVd) belongs to the family of Pospiviroidae. It was first identified in potato plants (Solanum tuberosum, Solanaceae), but it can infect a wide range of plants, including other members of the Solanaceae family and other important crops. Viroids can induce their hosts’ RNA silencing mechanism, while they are also targeted by it. In fact, PSTVd itself, and the small double-stranded RNA molecules produced during its replication, interact with core proteins of the RNA silencing machinery, such as DCL (Dicer-Like) endonucleases and AGO (Argonaute) proteins. In our study, we examined the interaction of viroids with the RNA silencing mechanism, hypothesizing that the phenotypic alterations caused by viroids are due to the induction of the RNA silencing mechanism. To approach this question, we used transgenic Nicotiana benthamiana plants that express and silence a GFP transgene in a spontaneous and stochastic manner. We showed that the induction of RNA silencing can cause changes in the expression of genes related to plant defense and stress responses, leading to phenotypic alterations under stress conditions, such as reduced growth and increased sensitivity to stress. Our study results support, to some extent, the hypothesis that the phenotypic alterations in viroid-infected plants may be caused by the induction of the RNA silencing mechanism by viroids. Additionally, many proteins that are potentially involved in the biological cycle of PSTVd have not yet been identified, although they may play a significant role in the viroid’s replication or movement within hosts. Viroids of the Pospiviroidae family replicate in the nucleus through an asymmetric rolling-circle mechanism. A type III endonuclease (RNAse III), which remains unidentified, is considered essential in this process. Plants have two groups of RNAse III endonucleases: DCL (Dicer-Like) and RTL (RNAse Three-Like). It has been reported that the combined suppression of DCL2 and DCL3 in the model plant N. benthamiana significantly affects the plant’s defense against viroids, while the members of the Pospiviroidae family may have evolved to be primarily cleaved by DCL4, which has the least detrimental effects on viroid infectivity. RTLs are the least studied of the two groups, and there is no information on their role upon viroid infections. In this study, we further investigated the effect of the main antiviral AGO proteins AGO1, AGO2, and AGO4 on viroid infectivity. Suppression of AGO1 and AGO2 resulted in a tendency for increased viroid levels in infected plants, indicating their potential defensive role, while silencing of the AGO4 gene was found to play a significant role in defense against PSTVd. We also examined the role of RTLs in the biological cycle of PSTVd in the plant N. benthamiana. We created transgenic N. benthamiana plants with suppressed expression of RTL genes. The total mRNA of the transgenic plants was sequenced to determine the pathways in which each targeted RTL is involved. We then used these plants for infection assays with PSTVd, assessing the viroid levels in each transgenic line to determine the effect of each RTL’s suppression on PSTVd infectivity. Finally, we examined the effect of simultaneous suppression of two RTLs on PSTVd levels. The simultaneous suppression of two RTL genes resulted in a significant increase in viroid levels. Therefore, we concluded that the combined action of N. benthamiana RTLs might be important for the effective plant defense against viroids.

Τα ιοειδή είναι μικρά, γυμνά, κυκλικά, μη κωδικά μόρια RNA που μπορούν να μολύνουν πολλά είδη φυτών. Το ιοειδές των ατρακτοειδών κονδύλων της πατάτας (Potato Spindle Tuber Viroid, PSTVd), που ανακαλύφθηκε πρώτο, ανήκει στην οικογένεια των Pospiviroidae και χρησιμοποιείται ως μοντέλο στην παρούσα εργασία. Ταυτοποιήθηκε αρχικά σε φυτά πατάτας (Solanum tuberosum, Solanaceae), αλλά μπορεί να μολύνει ένα ευρύ φάσμα ξενιστών, συμπεριλαμβανομένων άλλων μελών της οικογένειας Solanaceae και άλλων σημαντικών καλλιεργειών. Τα ιοειδή επάγουν τον μηχανισμό της RNA σίγησης στους ξενιστές τους, αλλά επίσης στοχεύονται και από αυτόν. Το PSTVd και τα μικρά δίκλωνα RNA μόρια που παράγονται κατά τον αναδιπλασιασμό του αλληλεπιδρούν με βασικές πρωτεΐνες του μηχανισμού της RNA σίγησης, όπως οι ενδονουκλεάσες Dicer-Like (DCL) και οι πρωτεΐνες Argonautes (AGO). Στην παρούσα εργασία εξετάσαμε την αλληλεπίδραση των ιοειδών με τον μηχανισμό της RNA σίγησης, υποθέτοντας ότι οι φαινοτυπικές αλλοιώσεις που προκαλούνται από τα ιοειδή οφείλονται στην επαγωγή του μηχανισμού της RNA σίγησης. Για να προσεγγίσουμε το ερώτημα αυτό, χρησιμοποιήσαμε ως εργαλείο διαγονιδιακά φυτά Nicotiana benthamiana, που εκφράζουν και σιγούν με αυθόρμητο και στοχαστικό τρόπο ένα GFP διαγονίδιο. Δείξαμε ότι η επαγωγή της RNA σίγησης από μόνη της προκαλεί αλλαγές στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με αμυντικές αποκρίσεις και καταπονήσεις, οδηγώντας σε φαινοτυπικές αλλοιώσεις υπό συνθήκες καταπόνησης, όπως μειωμένη ανάπτυξη και αυξημένη ευαισθησία σε καταπόνηση. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας υποστηρίζουν την υπόθεση ότι οι φαινοτυπικές αλλοιώσεις σε φυτά μολυσμένα με ιοειδή ίσως να προκαλούνται, σε κάποιο βαθμό, από την επαγωγή του μηχανισμού της RNA σίγησης από τα ιοειδή. Επιπλέον, πολλές πρωτεΐνες που πιθανώς εμπλέκονται στον βιολογικό κύκλο του ιοειδούς PSTVd δεν έχουν ταυτοποιηθεί ακόμη, παρόλο που μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στον αναδιπλασιασμό ή τη μετακίνησή του ιοειδούς στους ξενιστές. Τα ιοειδή της οικογένειας Pospiviroidae αναδιπλασιάζονται στον πυρήνα μέσω του μηχανισμού του ασύμμετρου κυλιόμενου κύκλου. Μια ενδονουκλεάση τύπου ΙΙΙ (RNAse III), η οποία παραμένει άγνωστη, θεωρείται απαραίτητη στη διαδικασία αυτή. Τα φυτά διαθέτουν δύο ομάδες RNAse III ενδονουκλεασών: τις DCL (Dicer-Like) και τις RTL (RNAse Three-Like). Έχει αναφερθεί ότι η συνδυασμένη καταστολή των DCL2 και DCL3 στο φυτό N. benthamiana επηρεάζει σημαντικά την άμυνα του φυτού έναντι των ιοειδών, ενώ τα μέλη των Pospiviroidae πιθανώς να έχουν εξελιχθεί έτσι ώστε να πέπτονται κυρίως από την DCL4, που έχει τις λιγότερο επιζήμιες επιπτώσεις στη μολυσματικότητα του ιοειδούς. Οι RTL αποτελούν τη λιγότερο μελετημένη από τις δύο ομάδες και δεν υπάρχουν πληροφορίες για το ρόλο τους κατά τη διάρκεια μολύνσεων με ιοειδή. Στην παρούσα μελέτη διερευνήσαμε περαιτέρω την επίδραση βασικών αντι-ιικών πρωτεϊνών AGO (AGO1, AGO2 και AGO4) στη μολυσματικότητα του ιοειδούς. Η καταστολή των AGO1 και AGO2 είχε ως αποτέλεσμα μια τάση για αύξηση των επιπέδων του ιοειδούς σε μολυσμένα φυτά, υποδεικνύοντας τον πιθανό αμυντικό τους ρόλο, ενώ η σίγηση του γονιδίου AGO4 βρέθηκε να έχει σημαντικό ρόλο στην άμυνα έναντι του PSTVd. Εξετάσαμε, επίσης, το ρόλο των RTL στον βιολογικό κύκλο του PSTVd στο φυτό N. benthamiana. Συγκεκριμένα, δημιουργήσαμε διαγονιδιακά φυτά N. benthamiana με κατασταλμένη έκφραση των RTL γονιδίων τους. Το ολικό mRNA των διαγονιδιακών φυτών αλληλουχήθηκε για να προσδιοριστούν τα μονοπάτια στα οποία συμμετέχει κάθε RTL που στοχεύσαμε. Έπειτα, χρησιμοποιήσαμε αυτά τα φυτά για μολύνσεις με το ιοειδές PSTVd, αξιολογώντας τα επίπεδα του ιοειδούς στις διάφορες διαγονιδιακές σειρές για να δούμε την επίδραση της μειωμένης έκφρασης κάθε RTL γονιδίου στα επίπεδα του PSTVd. Τέλος, εξετάσαμε την επίδραση της ταυτόχρονης καταστολής δύο RTL στη μολυσματικότητα του PSTVd. Η ταυτόχρονη καταστολή των RTL γονιδίων είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση των επιπέδων του ιοειδούς. Συνεπώς, συμπεράναμε ότι η συνδυαστική δράση των γονιδίων RTL γονιδίων που μελετήθηκαν είναι πιθανώς σημαντική για την αποτελεσματική άμυνα του φυτού έναντι των ιοειδών.