The function of neural networks in epileptic seizures with a combination of imaging and electrophysiological recordings: impact of novel therapeutic approaches

Abstract

According to the World Health Organization (WHO), epilepsy is one of the most common serious neurological chronic diseases, characterized by the occurrence of spontaneous recurrent seizures. Seizure activity occurs as transient episodes of abnormal and excessive neuronal activity in the brain. In particular, temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common type of epilepsy seen in adults. Around 33,3% of the patients are diagnosed with drug-resistant epilepsy, since current anti- epileptic drugs (AEDs) manage to effectively control seizures up to 66,7% of the patients. The etiology of seizure events is diverse but associated with an imbalance of excitation-inhibition in neuronal networks. Furthermore, epilepsy is linked to channelopathies, interneuronopathies, metabolic dysfunction, and also rhythmopathies. The diverse epileptogenesis mechanisms give rise to three primary limitations concerning seizure management. Firstly, there is the challenge of poor sensitivity and accuracy in predicting spontaneous seizures. Most predictive models aim to differentiate between pre-ictal, interictal, and ictal periods, yet defining these periods remains elusive. The duration and network alterations during these periods vary not only across different epilepsy types but also within individual patients. Secondly, the limited efficacy of current branded AEDs, which often come with various side effects. Our lack of understanding of all seizure-generating mechanisms adds to the difficulty in designing effective therapeutic strategies. These two aforementioned factors contribute to the third limitation: the propagation of seizures to a generalized form, affecting more brain regions and exacerbating cognitive deficits, which are common consequences of frequent epileptic discharges or AED administration. Our study addresses these limitations comprehensively, aiming to contribute to the development of novel and more effective therapeutic approaches; i) prediction of seizure onset based on pre-ictal oscillatory markers, ii) screening of novel anti-epileptic medications, and iii) cognitive training as a protective mechanism against SLEs. For the induction of spontaneous seizure-like events (SLEs) in HPC brain slices from adult male and female mice we employed the high K+ in vitro model. Specifically, we recorded spontaneous Local Field Potentials (LFPs) in three hippocampal subregions, namely: cornu amonis 1 and 3 (CA1, CA3) and dentate gyrus (DG), during the perfusion of either a sodium-based (mentioned as normal) artificial cerebrospinal fluid (N aCSF) or high K+ artificial cerebrospinal fluid (HK+ aCSF). Ictal events were evident in LFP recordings in the presence of HK+ aCSF. Next, the rates of power of oscillatory patterns were analyzed at different frequencies within same-duration time segments (1 second each) during pre-ictal, non-ictal and ictal periods. Training a Linear Discriminant Analysis (LDA) algorithm on oscillatory dynamics predicted the emergence of an ictal event 5 seconds before its onset, achieving an accuracy of approximately 85% for theta (θ), alpha (α) and high gamma (hγ) domains of the DG subfield. We next wanted to investigate the effects of novel anti-epileptic medications and compare their effects to two well-established AEDs, diazepam (DZP) and carbamazepine (CBZ). Our findings unveiled a subfield-dependent sensitivity to seizure mitigation by these two AEDs. Specifically, perfusion of DZP led to suppressed spiking and oscillatory activity, accompanied by a reduction in the number of Fos-positive cells in all HPC subfields. This extensive decrease in spontaneous activity may account for the sedative effects associated with DZP. Conversely, CBZ administration effectively inhibited ictal discharges, yet its efficacy was limited in suppressing interictal discharges in the DG subfield. Besides the study of the established AEDs, we investigated the anticonvulsant effects of a new AED, cannabidiol (CBD). Additionally, in pursuit of designing a novel and effective pharmacological approach to eliminate seizure events, we conducted a screening analysis of the anticonvulsant properties of a synthetic compound, GAT1508, a selective GIRK 1/2 agonist, and a natural compound from olive oil, oleocanthal (OLC) in HPC brain slices. Their effects were further explored through combined administration with CBD, revealing synergistic effects. Our results demonstrated a 3-fold decrease in the number of spikes when 5 μM of CBD were simultaneously perfused with 5 μM of GAT1508, compared to individual administration of 5 μM of CBD or GAT1508 alone in HK+ aCSF. Moreover, we observed a 2-fold decrease in spiking activity when 2,5 μM of CBD were simultaneously perfused with 20 μM of OLC, compared to their efficacy in reducing the number of spikes, when administered separately. In the third part of our study, we investigated a behavioral approach that could affect the generation of SLA. Specifically, we sought to explore the effects of cognitive training on synaptic plasticity, spontaneous activity, and seizure emergence. In a previous study conducted in our lab, we recorded significant increases in the number of spines in the prefrontal cortex (PFC) of adult male mice, accompanied by a significant increase in Long-term Potentiation (LTP). In the current study, we conducted working memory training (WMT) in different cohorts of adult female mice. Golgi-cox staining revealed a significant increase in the number of mature and total spines in the dendritic spine density analysis within the CA1 hippocampal subfield of female mice. Furthermore, a significant enhancement of LTP was observed one day and fourteen days post-training. Consequently, the effects of WMT were sustained for at least fourteen days post-training in female mice, indicating sex differences in synaptic plasticity attributable to WMT. Additionally, WMT led to increased spontaneous activity, both in spiking and oscillatory patterns, in the HPC of female mice. Notably, our study demonstrated neuroprotective effects of WMT in seizure mitigation, as perfusion of HK+ aCSF did not induce a further increase in spiking and oscillatory activity, as recorded in the CA1 subfield. Moreover, WMT resulted in a 72% reduction in the average number of ictal events recorded every 7.5 minutes, compared to control female mice. In conclusion, our study delved into three strategies for mitigating seizures, with the aim of addressing existing limitations in the field. Our findings offer promise in several key areas: firstly, they could lead to a more precise and subfield-dependent prediction of seizures; secondly, they may contribute to the development of more effective anti-seizure medications; and lastly, they suggest a potential neuroprotective role of WMT in reducing seizure frequency and thus mitigating cognitive deficits.

Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας, η επιληψία είναι μια από τις πιο συχνές, σοβαρές και χρόνιες νευρολογικές παθήσεις, που χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση αυθόρμητων επαναλαμβανόμενων επιληπτικών κρίσεων. Ως επιληπτική κρίση ορίζεται ένα επεισόδιο παροδικής, ανώμαλης και υπερβολικής νευρωνικής δραστηριότητας στον εγκέφαλο. Ειδικότερα, η επιληψία του μέσου κροταφικού λοβού απαντάται στον πιο συνήθη τύπο επιληψίας που παρατηρείται στους ενήλικες. Από αυτούς, περίπου το 33,3% των ασθενών διαγιγνώσκεται με φαρμακοανθεκτική επιληψία, καθώς τα υπάρχοντα αντιεπιληπτικά φάρμακα (ΑΕΦ) καταφέρνουν να ελέγξουν αποτελεσματικά τις επιληπτικές κρίσεις σε ποσοστό έως 66,7% των ασθενών. Τα αίτια εμφάνισης επιληπτικών κρίσεων ποικίλουν, όμως σίγουρα σχετίζονται με την εμφάνιση ανισορροπίας μεταξύ διεγερτικών και ανασταλτικών διεργασιών στα νευρωνικά δίκτυα. Συγκεκριμένα, η επιληψία έχει χαρακτηριστεί ως πάθηση διαφόρων διαύλων, πάθηση ενδονευρώνων, μεταβολική διαταραχή, αλλά και ως πάθηση δυσρυθμίας.Το εύρος των εκλυτικών παραγόντων που μπορούν να οδηγήσουν στην εμφάνιση επιληπτικών κρίσεων καθιστούν την αποτελεσματική διαχείριση των τελευταίων ιδιαιτέρως δύσκολη, λόγω τριών βασικών περιορισμών. Ο πρώτος περιορισμός έγκειται στην αναποτελεσματική πρόβλεψη των επιληπτικών κρίσεων λόγω χαμηλής ευαισθησίας και ακρίβειας. Τα περισσότερα μοντέλα πρόβλεψης στοχεύουν στη διάκριση μεταξύ τριών περιόδων: α) την περίοδο πριν την επιληπτική κρίση, β) την περίοδο μεταξύ των επιληπτικών κρίσεων και γ) την περίοδο των επιληπτικών κρίσεων. Ωστόσο, ο ορισμός αυτών των περιόδων παραμένει ασαφής, καθώς η αόριστη διάρκεια τους σε συνδυασμό με τις ποικίλλες επαγώμενες μεταβολές στο δίκτυο εντοπίζονται όχι μόνο σε διαφορετικούς τύπους επιληψίας αλλά και μεταξύ των επιληπτικών κρίσεων που παρουσιάζονται στον ίδιο ασθενή. Ο δεύτερος περιορισμός εντοπίζεται στην μετριασμένη αποτελεσματικότητα των ΑΕΦ, τα οποία συχνά συνοδεύονται από διάφορες παρενέργειες. Είναι σημαντικό να αναφερθεί πως η έλλειψη κατανόησης όλων των μηχανισμών που διέπουν τις επιληπτικές κρίσεις αυξάνει τη δυσκολία σχεδιασμού μιας αποτελεσματικής θεραπευτικής προσέγγισης. Οι δύο προαναφερθέντες περιορισμοί οδηγούν στην εξέλιξη των εστιακών επιληπτικών κρίσεων σε γενικευμένη μορφή, επηρεάζοντας έτσι περισσότερες περιοχές του εγκεφάλου. Συνεπώς, οδηγούμαστε στον τρίτο περιορισμό που επιδρά στην επιδείνωση των γνωστικών ελλειμμάτων, η εμφάνιση των οποίων αποτελεί κοινή συνέπεια των συχνών επιληπτικών κρίσεων ή και ακόμη της χορήγησης ορισμένων ΑΕΦ. Η μελέτη μας θέτει ως στόχο την προσπάθεια αντιμετώπισης αυτών των περιορισμών συμβάλλοντας στην ανάπτυξη νέων και αποτελεσματικότερων θεραπευτικών προσεγγίσεων, μέσω α)πρόβλεψης των επιληπτικών κρίσεων με βάση ορισμένες διαφορές στις νευρωνικές ταλαντώσεις που αξιοποιήθηκαν ως δείκτες, β) μελέτης νέων αντι-επιληπτικών φαρμακευτικών προσεγγίσεων και γ) εξάσκησης γνωστικών λειτουργιών ως νευροπροστατευτικός μηχανισμός μείωσης της συχνότητας εμφάνισης επιληπτικών κρίσεων. Για την μελέτη αυθόρμητων επιληπτικών κρίσεων απομονώθηκαν τομές εγκεφάλου που περιέχουν την περιοχή του ιππόκαμπου (ΙΠΚ) από ενήλικους αρσενικούς και θηλυκούς μύες. Για την επαγωγή αυθόρμητων επιληπτικών κρίσεων χρησιμοποιήσαμε το in vitro μοντέλο υψηλής συγκέντρωσης καλίου (Κ+) και καταγράψαμε την αυθόρμητη δραστηριότητα με εξωκυττάριες καταγραφές πεδίου σε τρεις υποπεριοχές του ΙΠΚ, συγκεκριμένα: cornu amonis 1 και 3 (CA1, CA3) και οδοντωτή έλικα (ΟΕ). Στην μελέτη αυτή, καταγράφηκαν διακριτές διαφορές στην ρυθμική δραστηριότητα που καταγράφηκε κυρίως στις περιοχές CA3 και DG, κατά τη διάρκεια επώασης των εγκεφαλικών τομών είτε σε τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό που προσομειάζει το φυσιολογικό είτε σε τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό με υψηλή περιεκτικότητα σε Κ+. Επιπλέον, ορίστηκαν συγκεκριμένα χρονικά τμημάτα διάρκειας 1 δευτερολέπτου, σε καταγραφές συνολικής διάρκειας 10 δευτερολέπτων, κατά τη διάρκεια των εξής περιόδων: α) το διάστημα πριν τις επιληπτικές κρίσεις (ΠΚ), β) το διάστημα απουσίας επιληπτικών κρίσεων (ΑΚ) και γ) το διάστημα κατά την διάρκεια των κρίσεων (Κ). Εν συνεχεία, στα τμήματα αυτά καταγράφηκε η ρυθμική δραστηριότητα η οποία παρουσίασε σημαντικές διακυμάνσεις μεταξύ των περιόδων ΠΚ - Κ, ΠΚ - ΑΚ καθώς και Κ – ΑΚ. Μέσω της χρήσης του αλγορίθμου της Γραμμικής Διακριτικής Ανάλυσης από τα δεδομένα της ρυθμικής δραστηριότητας που καταγράφηκε στα προαναφερθέντα χρονικά τμήματα, προβλέψαμε την επικείμενη εμφάνιση μιας κρίσης 5 δευτερόλεπτα πριν την έναρξη της, επιτυγχάνοντας ακρίβεια περίπου 85% για τους ρυθμούς θήτα (θ), άλφα (α) και υψηλή γάμμα συχνότητα (hγ) για την περιοχή της ΟΕ.Ως προς το κομμάτι της μελέτης μας που αφορά στη θεραπευτική προσέγγιση, παρατηρήσαμε ότι οι τρεις περιοχές εμφανίζουν διαφορετική ευαισθησία στη μείωση των κρίσεων έπειτα από χορήγηση δύο ευρέως χρησιμοποιούμενων ΑΕΦ, τη διαζεπάμη (ΔΖΠ) και την καρβαμαζεπίνη (ΚΒΖ). Συγκεκριμένα, η επώαση των τομών σε ΔΖΠ οδήγησε σε καταστολή των δυναμικών πυροδότησης καθώς και της ρυθμικής δραστηριότητας, ενώ παράλληλα μείωσε τον αριθμό των κυττάρων που εκφράζουν την πρωτείνη Fos και στις τρεις υποπεριοχές του ΙΠΚ. Αυτή η ομολογουμένως εκτεταμένη μείωση της αυθόρμητης δραστηριότητας μπορεί να εξηγεί τις κατασταλτικές επιδράσεις της ΔΖΠ. Αντίθετα, η χορήγηση της ΚΒΖ ανέστειλε αποτελεσματικά τις κρίσεις, ωστόσο η αποτελεσματικότητά της ήταν περιορισμένη στην καταστολή των ενδιάμεσων επιληπτικών εκπολώσεων στην περιχή της ΟΕ. Πέραν της μελέτης των καθιερωμένων ΑΕΦ, διερευνήσαμε τις αντι-επιληπτικές ιδιότητες ενός προσφάτως εγκεκριμένου ΑΕΦ, την κανναβιδιόλη (ΚΒΔ). Επιπλέον, έχοντας ως στόχο τον σχεδιασμό μιας νέας, αποτελεσματικής φαρμακολογικής προσέγγισης για την εξάλειψη των επιληπτικών κρίσεων, διερευνήσαμε τις αντι-επιληπτικές ιδιότητες μιας νέας συνθετικής ένωσης, του GAT1508, ενός εκλεκτικού αγωνιστή των GIRK 1/2, και ενός φυσικού προιόντος που απομονώθηκε από το ελαιόλαδο, την ελαιοκανθάλη (ΕΛΚ) σε ΙΠΚ τομές εγκεφάλου. Οι αντι-επιληπτικές τους ιδιότητες διερευνήθηκαν περαιτέρω μέσω της ταυτόχρονης χορήγησης τους με ΚΒΔ, αποκαλύπτοντας συνεργιστική δράση. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν τριπλάσια μείωση του αριθμού των δυναμικών πυροδότησης σε ΙΠΚ τομές, όταν 5 μΜ ΚΒΔ χορηγήθηκαν ταυτόχρονα με 5 μΜ GAT1508, σε σύγκριση με τη μεμονωμένη χορήγηση 5 μΜ ΚΒΔ ή GAT1508 διαλυμένα σε τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό υψηλής περιεκτικότητας σε Κ+. Όσον αφορά στον άλλον συνδυασμό, παρατηρήσαμε μείωση των δυναμικών πυροδότησης κατά δύο φορές όταν 2,5 μΜ ΚΒΔ χορηγήθηκαν ταυτόχρονα με 20 μΜ ΕΛΚ, σε σύγκριση με την αποτελεσματικότητά τους στη μείωση των δυναμικών πυροδότησης, όταν χορηγήθηκαν χωριστά σε ΙΠΚ τομές που επωάζονταν σε τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό υψηλής περιεκτικότητας σε Κ+.Επιπροσθέτως, η εκτεταμένη εμφάνιση ή διάδοση των επιληπτικών κρίσεων οδηγεί στην εμφάνιση γνωστικών ελλειμμάτων. Στα πλαίσια της μελέτης μας επιδιώξαμε να διερευνήσουμε την επίδραση της εξάσκησης της μνήμης εργασίας (ΕΜΕ) στη συναπτική πλαστικότητα, στην αυθόρμητη δραστηριότητα και στην εμφάνιση επιληπτικών κρίσεων. Για την επίτευξη αυτού, πραγματοποιήσαμε ΕΜΕ σε διαφορετικές ομάδες ενήλικων θηλυκών μυών. Σε προηγούμενη μελέτη που διεξήχθη στο εργαστήριό μας, καταγράψαμε σημαντικές αυξήσεις τόσο στον αριθμό των δενδριτικών ακανθών στον προμετωπιαίο φλοιό ενήλικων αρσενικών μυών, όσο και στην μακρόχρονη συναπτική ενδυνάμωση (ΜΣΕ). Στην παρούσα μελέτη, μέσω της χρώσης Golgi-cox εντωπίσαμε σημαντική αύξηση του αριθμού των ώριμων και των συνολικών δενδριτικών ακανθών στην CA1 υποπεριοχή του ΙΠΚ των θηλυκών μυών. Επιπλέον, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της ΜΣΕ έπειτα από 1 και 14 ημέρες μετά την ΕΜΕ. Κατά συνέπεια, η επίδραση της ΕΜΕ ήταν εμφανής για τουλάχιστον 14 ημέρες μετά την εξάσκηση στους ΙΠΚ των θηλυκών μυών, υποδεικνύοντας φυλετικές διαφορές στη συναπτική πλαστικότητα που εντοπίζονται έπειτα απο ΕΜΕ. Επιπλέον, η ΕΜΕ οδήγησε τόσο σε αυξημένα δυναμικά πυροδότησης όσο και σε αυξημένη ρυθμική δραστηριότητα στον ΙΠΚ θηλυκών μυών. Ειδικότερα, η μελέτη μας έδειξε πως η ΕΜΕ παρουσιάζει νευροπροστατευτικές ιδιότητες στην μέιωση των επιληπτικών κρίσεων, καθώς η επώαση των τομών ΙΠΚ σε τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό υψηλής περιεκτικότητας σε Κ+ δεν προκάλεσε παθολογική αύξηση της αυθόρμητης δραστηριότητας στην CA1 περιοχή των θυληκών μυών που είχαν υποβληθεί προηγουμένως σε ΕΜΕ. Ως εκ τούτου, η ΕΜΕ είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του μέσου αριθμού των επιληπτικών κρίσεων που καταγράφηκαν κάθε 7,5 λεπτά, σε ποσοστό 72% , σε σύγκριση με τους θηλυκούς μύες της ομάδας ελέγχου. Συνοψίζοντας, η μελέτη μας σε μια προσπάθεια να άρει τους υπάρχοντες περιορισμούς στην διαχείριση των επιληπτικών κρίσεων αξιοποίησε τρεις διαφορετικές προσεγγίσεις. Τα αποτελέσματά αυτής, στοχεύουν στην ακριβή πρόβλεψη των επικείμενων κρίσεων, στην ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπευτικών προσεγγίσεων και τέλος, υποδεικνύοουν πως η ΕΜΕ δρα νευροπροστατευτικά στη μείωση της συχνότητας εμφάνισης των επιληπτικών κρίσεων και κατ’ επέκταση, θα μπορούσε να συμβάλει στη μείωση των γνωστικών ελλειμμάτων.