Ανάπτυξη νέων αναλυτικών τεχνικών για τις βιοδραστικές φαινόλες της ελιάς και μελέτη της δραστικότητας τους σε ανθρώπους και σε κυτταρικές σειρές ανθρώπινης προέλευσης

Abstract

The olive tree (Olea europaea) holds significant cultural importance both in Greece and throughout the whole Mediterranean region, where it has been cultivated for thousands of years. Nowadays, olive cultivation represents an important economic and cultural pillar of modern agriculture around the world. Olive oil, derived from the mechanical processing of olive fruit, is one of the most important edible oils and a fundamental component of the Mediterranean diet. This dietary model, with millennia of history, has been associated with numerous health benefits, many of which have been correlated with olive oil consumption. Many studies have demonstrated that the phenolic fraction of olive oil is responsible for its significant health-protective properties rather than its lipid composition. The phenolic compounds of olive oil have been found to have significant chemoprotective and anticancer properties against various types of cancer, as well as beneficial effects on many cardiovascular and neurodegenerative diseases, while numerous studies also support their beneficial activity in conditions such as diabetes and osteoporosis. In the context of the present thesis, we focused on the olive oil phenols - oleocanthal, oleuropein, oleuropein aglycone, aglycone ligstroside, oleomissional, and oleocanthalic acid – and we investigated two important areas around phenols: quantitative analysis methods and their anticancer properties in both ex vivo and in vivo systems. In the first part (Chapter 1), introductory information regarding the olive tree, the olive fruit, and olive oil is provided, including historical data, botanical classification, cultivation, varieties, chemical composition etc. The biological significance of olive oil is described in depth, both through the Mediterranean Diet and due to its phenolic components. Finally, an extensive reference to the most important scientific findings regarding the health-promoting properties of each of the most important olive oil phenols is made. The second part is divided into 6 chapters, where the methods, materials, experimental results, and conclusions are presented, along with some introductory information necessary for the discussion of the results. In the first experimental section (Chapters 2-3), initially are presented the experimental protocols used for the isolation and identification of the isolated phenols used in the rest of this work. Then, the development and the application of specific analysis methods for phenols quantification in olive oil samples or biological fluids are presented. More specifically, Chapter 2 describes the development of two analytical methods that can easily and rapidly quantify olive oil phenols either in olive oil samples or in solutions of isolated compounds. The first method concerns the quantitative determination of the total aldehydic content in olive oil samples or solutions of isolated compounds by volumetric titration. The development of two different experimental protocols was carried out. According to the first protocol, the determination of the titration endpoint is performed using a colored indicator, thus the accuracy of the measurements is lower. As per the other protocol, the determination of the titration endpoint is carried out by measuring the pH of the solution with a high accuracy electronic pH meter, resulting in more accurate final measurements. The second analytical method developed in this chapter concerns a selective quantification method for diphenols (i.e., substances possessing two hydroxy groups on the aromatic ring, such as oleacein, aglycone oleuropein, and oleomissional) using UV-Vis spectroscopy. The concentration of isolated diphenols in solutions can be determined with this method. Chapter 3 includes the analysis of human biological urine samples by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) using a published protocol for the quantification of tyrosol and hydroxytyrosol - substances that are major metabolites of olive oil phenols. The ultimate goal of this study was to investigate the potential use of these metabolites as biomarkers to assess compliance with the Mediterranean Diet of individuals participating in nutritional interventions. This analysis was a sub-study of a larger study known as "Feeding America's Bravest". In the second experimental section (Chapters 4-7), a systematic ex vivo study of the anticancer properties of olive oil phenols and total phenolic extracts of olive oil, as well as two pilot in vivo experiments assessing their effect on a xenograf breast cancer model are presented. More specifically, in Chapter 4, a systematic study of the effect of six bioactive olive phenols on the viability of a large number of cancer cell lines derived from 8 different tissues is conducted for the first time, both at optimal culture conditions and at conditions resembling the tumor microenvironment (i.e., hypoxia and serum starvation). Moreover, the test results of the cytotoxic olive oil phenols’ activity on non-tumorigenic cell lines are presented. In Chapter 5, the synergistic effect of olive oil phenols either as double combinations of isolated compounds or as olive oil phenolic extracts, against cancer and non-cancer cell lines is studied. In Chapter 6 we explored the potential mechanism by which the inhibition of cancer cell viability observed in previous chapters is achieved. More specifically, the ability of phenols to inhibit the proliferation of cancer cells derived from different types of cancer was initially evaluated. Subsequently, it was studied whether the incubation of cells with these substances could lead the cells to programmed cell death. Using fluorescence microscopy, the effect of olive oil phenols on cell morphology was tested. Finally, in Chapter 7, two pilot in vivo experiments are presented, where the ability of the most active phenols as well as an olive oil extract rich in oleocanthal and oleace in to prevent tumorigenesis/carcinogenesis, after their intraperitoneal and per os administration, was investigated using xenograft breast cancer models.

Το ελαιόδεντρο (Olea europaea) έχει ιδιαίτερη πολιτιστική σημασία τόσο για την Ελλάδα, όσο και για την ευρύτερη περιοχή της Μεσογείου, όπου η καλλιέργεια του έχει χιλιάδες χρόνια ιστορία. Η καλλιέργεια της ελιάς παραμένει σήμερα ζωντανή αντιπροσωπεύοντας έναν οικονομικό και πολιτιστικό πυλώνα της σύγχρονης γεωργίας παγκοσμίως. Το ελαιόλαδο, που είναι το προϊόν επεξεργασίας του καρπού της ελιάς με μηχανικά μέσα, αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα βρώσιμα έλαια και βασικό συστατικό της Μεσογειακής διατροφής. Το διατροφικό αυτό μοντέλο διατροφής, με χιλιετίες ιστορίας, έχει συνδεθεί με πολύ ευεργετικά αποτελέσματα για την υγεία, πολλά από τα οποία συσχετίζονται με το ελαιόλαδο. Μάλιστα, τα τελευταία χρόνια, πληθώρα μελετών αποδεικνύουν ότι υπεύθυνο για τις σημαντικές υγειοπροστατευτικές ιδιότητες του ελαιολάδου είναι περισσότερο το φαινολικό του κλάσμα, παρά η λιπιδική του σύσταση. Οι φαινολικές ενώσεις του ελαιολάδου έχουν βρεθεί ότι διαθέτουν σημαντικές χημειοπροστατευτικές και αντικαρκινικές ιδιότητες έναντι πολλών ειδών καρκίνου, δρουν ευεργετικά σε πολλές καρδιαγγειακές και νευροεκφυλιστικές παθήσεις, ενώ πολλές μελέτες υποστηρίζουν επίσης την ευεργετική τους δράση και σε άλλες ασθένειες όπως ο διαβήτης και η οστεοπόρωση. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, ασχοληθήκαμε με τις φαινόλες της ελιάς - ελαιοκανθάλη, ελαιασίνη, άγλυκο ελευρωπαΐνης, άγλυκο λιγκστροσίδη, ελαιομισσιονάλη και ελαιοκανθαλικό οξύ – εστιάζοντας σε δύο σημαντικούς τομείς μελέτης τους: τις μεθόδους ποσοτικής ανάλυσης και τις αντικαρκινικές ιδιότητές τους τόσο σε ex vivo όσο και σε in vivo συστήματα. Στο πρώτο μέρος (Κεφάλαιο 1), παρατίθενται κάποια εισαγωγικά στοιχεία σχετικά με το ελαιόδεντρο τον καρπό της ελιάς και το ελαιόλαδο, που συμπεριλαμβάνουν κάποια ιστορικά στοιχεία, τη βοτανική κατάταξη, την καλλιέργεια, τις ποικιλίες, τη χημική σύσταση του ελαιολάδου κ.ά. Περιγράφεται αναλυτικά η βιολογική σημασία του ελαιολάδου τόσο μέσα από την Μεσογειακή Διατροφή όσο και λόγω των φαινολικών συστατικών του. Τέλος, γίνεται εκτενής αναφορά των κυριότερων επιστημονικών ευρημάτων σχετικά με τις ευεργετικές για την υγεία ιδιότητες καθεμιάς από τις σημαντικότερες φαινόλες του ελαιολάδου. Το δεύτερο μέρος χωρίζεται σε 6 κεφάλαια, όπου παρουσιάζονται οι μέθοδοι, τα υλικά, τα πειραματικά αποτελέσματα και συμπεράσματα, καθώς και κάποια εισαγωγικά στοιχεία απαραίτητα για την διεξαγωγή της συζήτησης των αποτελεσμάτων. Στην πρώτη πειραματική ενότητα (Κεφάλαια 2-3), αρχικά παρουσιάζονται τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση και ταυτοποίηση των καθαρών φαινολών τα οποία χρησιμοποιήθηκαν στην υπόλοιπη εργασία. Στην συνέχεια, παρουσιάζεται η ανάπτυξη και εφαρμογή κάποιων μεθόδων ανάλυσης για τον ποσοτικό προσδιορισμό των φαινολών της ελιάς σε δείγματα ελαιολάδου ή βιολογικά υγρά. Πιο συγκεκριμένα, στο Κεφάλαιο 2 περιγράφεται η ανάπτυξη δύο αναλυτικών μεθόδων με τις οποίες μπορεί να γίνει εύκολα και γρήγορα μια ποσοτική εκτίμηση των υπό μελέτη φαινολών είτε σε δείγματα ελαιολάδου είτε σε διαλύματα απομονωμένων φαινολών. Η πρώτη μέθοδος ανάλυσης αφορά τον ποσοτικό προσδιορισμό του συνολικού αλδεϋδικού περιεχομένου δειγμάτων ελαιολάδου ή διαλυμάτων απομονωμένων ουσιών με την χρήση μεθόδου ογκομέτρησης. Μάλιστα, όσον αφορά στη μέθοδο αυτή έγινε ανάπτυξη δύο διαφορετικών πρωτοκόλλων. Στο ένα ο προσδιορισμός του τελικού σημείου της ογκομέτρησης γίνεται με τη χρήση δείκτη, με μικρότερη ακρίβεια στις μετρήσεις, ενώ στο άλλο, ο προσδιορισμός του τελικού σημείου πραγματοποιείται με μέτρηση του pH του διαλύματος με ηλεκτρονικό πεχάμετρο ακριβείας, με αποτέλεσμα οι τελικές μετρήσεις να είναι πιο ακριβείς. Η δεύτερη αναλυτική μέθοδος που αναπτύχθηκε στο κεφάλαιο αυτό, αφορά μια μέθοδο εκλεκτικού ποσοτικού προσδιορισμού των διφαινολών (δηλαδή ουσιών που διαθέτουν δύο υδροξυλομάδες στον αρωματικό δακτύλιο (ελαιασίνη, άγλυκο ελευρωπαΐνης και ελαιομισσιονάλη), με τη χρήση φασματοσκοπίας UV-Vis, η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό περιεκτικότητας διαλυμάτων απομονωμένων διφαινολών. Το Κεφάλαιο 3 περιλαμβάνει την ανάλυση ανθρώπινων βιολογικών δειγμάτων ούρων, με τη χρήση αέριας χρωματογραφίας συζευγμένης με φασματογράφο μάζας (GC-MS), για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητάς τους σε τυροσόλη και υδροξυτυροσόλη - ουσίες που αποτελούν βασικούς μεταβολίτες των φαινολών του ελαιολάδου στα ούρα – εφαρμόζοντας ένα ήδη ανεπτυγμένο πρωτόκολλο. Απώτερος στόχος της μελέτης αυτής ήταν να διαπιστωθεί αν οι μεταβολίτες αυτοί μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες αξιολόγησης της συμμόρφωσης στην Μεσογειακή Διατροφή ατόμων που συμμετέχουν σε μελέτες με διατροφικές παρεμβάσεις. Αυτή η ανάλυση πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια μιας ευρύτερης μελέτης γνωστής ως «Feeding America’s Bravest». Στην δεύτερη πειραματική ενότητα (Κεφάλαια 4-7), παρουσιάζεται μια συστηματική ex vivo μελέτη των αντικαρκινικών ιδιοτήτων των φαινολών της ελιάς και ολικών φαινολικών εκχυλισμάτων ελαιολάδου, καθώς επίσης παρουσιάζονται τα αποτελέσματα από πιλοτικά in vivo πειράματα σχετικά με την επίδραση κάποιων φαινολών στον καρκίνο του μαστού. Πιο συγκεκριμένα, στο Κεφάλαιο 4 παρουσιάζεται για πρώτη φορά μια συστηματική μελέτη της επίδρασης των 6 βιοδραστικών φαινολών της ελιάς στην βιωσιμότητα μεγάλου αριθμού καρκινικών κυτταρικών σειρών προερχόμενων από 8 διαφορετικούς ιστούς, τόσο σε βέλτιστες συνθήκες καλλιέργειας, όσο και σε συνθήκες που προσομοιάζουν το μικροπεριβάλλον του όγκου (δηλ. υποξίας και περιορισμένων θρεπτικών συστατικών). Παράλληλα, παρουσιάζονται αποτελέσματα πειραμάτων ελέγχου κυτταροτοξικότητας των φαινολών σε μη ογκογόνες κυτταρικές σειρές. Στο Κεφάλαιο 5, μελετάται η συνεργιστική δράση των φαινολών της ελιάς είτε σε διπλούς συνδυασμούς απομονωμένων φαινολών είτε ως φαινολικά εκχυλίσματα ελαιολάδου, έναντι καρκινικών και μη καρκινικών κυτταρικών σειρών. Στο Κεφάλαιο 6 διερευνώνται οι πιθανοί μηχανισμοί μέσω των οποίων επιτυγχάνεται η αναστολή της βιωσιμότητας των καρκινικών κυττάρων που παρατηρήθηκε στα προηγούμενα κεφάλαια. Πιο συγκεκριμένα, αρχικά αξιολογήθηκε η ικανότητα των φαινολών να παρεμποδίζουν τον πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων προερχόμενων από διαφορετικούς τύπους καρκίνου, ενώ στη συνέχεια μελετήθηκε κατά πόσο η επώαση των κυττάρων με τις ουσίες αυτές μπορεί να οδηγήσει τα κύτταρα σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Επίσης, με τη βοήθεια της μικροσκοπίας φθορισμού ελέγχθηκε η επίδραση των φαινολών της ελιάς στη μορφολογία των κυττάρων. Τέλος, στο Κεφάλαιο 7, παρουσιάζονται δύο πιλοτικά in vivo πειράματα σε ζωïκά καρκινικά μοντέλα ξενομοσχευμάτων καρκίνου μαστού, όπου ελέγχθηκε η ικανότητα των πιο δραστικών από τις υπό μελέτη φαινόλες αλλά και ενός εκχυλίσματος ελαιολάδου πλούσιο σε ελαιοκανθάλη και ελαιασίνη να παρεμποδίζουν την ογκογένεση/καρκινογένεση, μετά από ενδοπεριτοναϊκή και per os χορήγησή τους.