Παραγωγή φορέων FV για τη δημιουργία iPSC και κυττάρων CAR-T προερχόμενων από αιμοποιητικά κύτταρα

Abstract

Gene therapy (GT) aims at correcting the genetic lesion of monogenic disorders through the transfer of the correct copy of a dysfunctional gene. Viral vectors are widely used to this end owing to the ease of production and the high gene transfer rates. Beyond monogenic disorders, viral vectors have been used for the production of Chimeric Antigen Receptor T-cells (CAR-T cells) that have revolutionized cancer treatment by allowing self-T-cells to attack the tumor, irrespective of HLA Class-I. The Aim of this study was the establishment of iPSC lines for the limitless production of T- and subsequently of CAR-T cells. However, due to production failures, we investigated whether cord blood-derived T-cells could serve this purpose. We developed Lenti- and Foamy Virus derived vectors and generated antiCD-19 CAR-T cells. Both FV and LV were produced at high titers and both could transduce CB- and Peripheral blood-derived T-cells at high efficiency. In addition, cytotoxicity rates against the CD19+ Raji line were comparable between the two cell sources indicating the functional competence of our vectors and of the CB-derived T-cells. In addition, retroviral integration site analysis, confirmed the relatively safe integration profile of FV vectors, something that has been established in other cell types. In conclusion, we developed FV and LV vectors for the production of antiCD19 CAR-T cells, we confirmed their functional competence and we set the stage for the use of CB-derived T-cells. These units were destined for disposal since their CD34+ numbers were lower than the std threshold; our approach has contributed to an alternative use of these units that could lead to a new production line with wide implementations.

Η γονιδιακή θεραπεία (ΓΘ) στοχεύει στην θεραπεία μονογονιδιακών νόσων μέσω της γενετικής τροποποίησης οργανισμών ή κυττάρων. Οι ιικές μέθοδοι γονιδιακής μεταφοράς έχουν επικρατήσει στις εφαρμογές γονιδιακής θεραπείας λόγω της ευκολίας παραγωγής των φορέων και της αποδοτικότητας της γενετικής μεταφοράς. Εκτός από την εφαρμογή της ΓΘ στα μονογονιδιακά νοσήματα, μεγάλο πεδίο εφαρμογής έχει βρει η γονιδιακή μεταφορά στη δημιουργία των CΑR Τ κυττάρων κάτι που έφερε επανάσταση στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου, καθώς επέτρεψε στα Τ λεμφοκύτταρα να στοχεύουν αντιγόνα του όγκου ανεξάρτητα του Μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας-Ι. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η παραγωγή iPSC κυττάρων μέσω ενός συστήματος φορέων FV για την ανεξάντλητη παραγωγή Τ-κυττάρων και CAR-Τ κυττάρων. Λόγω αδυναμιών του συστήματος να επιτύχει πλήρη επαναπρογραμματισμό, χρησιμοποιήθηκαν Τ-κύτταρα από μονάδες ομφαλοπλακουντιακού αίματος και από υγιείς δότες.Αναπτύχθηκαν Lenti- και Foamy Virus φορείς για την κατασκευή CAR T κυττάρων με ειδικότητα ενάντια στο CD19 αντιγόνο επιφανείας. Οι φορείς παρήγαγαν υψηλούς ιικούς τίτλους και χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή αντι-CD19 CΑR Τ κυττάρων από Τ λεμφοκύτταρα που απομονώθηκαν από μονάδες ΟΠΑ ή από περιφερικό αίμα υγιών δοτών. Η ικανότητα μεταγωγής των FV φορέων για να παράγουν CAR T ήταν συγκρίσιμη με εκείνη των LV ανεξάρτητα από την προέλευση των Τ λεμφοκυττάρων. Η έκφραση των CAR στην επιφάνεια των κυττάρων ήταν υψηλή τόσο για τα FV CAR19 T όσο και για τα LV CAR 19 T κύτταρα. Λειτουργικά όσον αφορά τον κυτταροτοξικό μηχανισμό τα FV CAR19 T εμφάνιζαν συγκρίσιμη κυτταροτοξική δράση ενάντια στην CD19+ κυτταρική σειρά Raji με τα LV CAR 19 T. Η ανάλυση των θέσεων ενσωμάτωσης των FV φορέων στα FV CAR19 T από περιφερικό αίμα έδειξε να είναι τυχαία και πάνω από τις μισές θέσεις ενσωμάτωσης ταυτοποιήθηκαν σε διαγονιδιακές περιοχές. Εν κατακλείδι, αναπτύξαμε FV και LV φορείς για την παραγωγή antiCD19 CAR-T κυττάρων, πιστοποιήσαμε τη λειτουργικότητά τους και θέσαμε τη βάση για τη χρήση Τ-κυττάρων από μονάδες ΟΠΑ που ήταν προς απόρριψη συμβάλλοντας στη λειτουργική αξιολόγηση ενός ανθρώπινου προϊόντος σε μία νέα εφαρμογή.