Ανάπτυξη καινοτόμου μεθοδολογίας για την ανίχνευση παθογόνων βακτηρίων στα τρόφιμα

Abstract

The present PhD thesis aims to evaluate and compare different detection methods for two common foodborne pathogens, Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium and Escherichia coli, in various food matrices. The purpose of this research is to enhance food safety by improving the detection and identification of pathogens in food samples through the creation of a microfluidic device based on molecular techniques (loop mediated isothermal amplification - LAMP) which will be able to perform microbiological analyzes of food samples. The methodology involved conducting a comprehensive literature review to gain insights into existing detection methods and their limitations. Based on the review, four specific detection methods were selected for evaluation: polymerase chain reaction (PCR), immunoassays, biosensors, and next-generation sequencing (NGS).In the present study, 11 different microorganism DNA isolation methods were first tested and then identified by the molecular techniques mentioned (PCR-LAMP).Then the combination of the in-house method we mention in combination with LAMP (being a more sensitive and rapid molecular technique than PCR) was chosen as optimal in terms of time-cost-sensitivity and finally combined with a 3D microfluidic device. To evaluate the performance of these methods, artificially contaminated food samples such as lettuce, milk and chicken were used as test matrices. Each method was evaluated based on its sensitivity, specificity, time requirement, cost, and ease of use. Additionally, the potential of these methods to identify specific virulence factors and antimicrobial resistance genes associated with target pathogens was explored. The results of the study showed different performances between the detection methods. PCR and NGS demonstrated high sensitivity and specificity, allowing accurate detection and identification of pathogenic targets. Immunoassays showed good specificity but limited sensitivity, while biosensors offered detection speed but required further optimization for enhanced sensitivity. Practical considerations for implementing these detection methods in food testing15laboratories are also discussed, including equipment requirements, available reagents and cost-effectiveness. In addition, recommendations for future research were given, emphasizing the need for extensive variety of strains and samples, comprehensive validation against reference methods, and investigation of automation and high-throughput analysis. This comparative study provides valuable insights into methods for the detection of Listeria monocytogenes and Escherichia coli in food samples. The findings contribute to the development of improved strategies for early and accurate detection of foodborne pathogens, ultimately enhancing food safety and public health. Further research is needed to address the limitations identified and to explore new avenues for real-time detection of various food labels.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στην αξιολόγηση και σύγκριση διαφορετικών μεθόδων ανίχνευσης για ή τρία κοινά τροφιμογενή παθογόνα, τη Listeria monocytogenes, την Escherichia coli και τη Salmonella Typhimurium, σε διάφορες μήτρες τροφίμων. Σκοπός αυτής της έρευνας είναι η ενίσχυση της ασφάλειας των τροφίμων με τη βελτίωση της ανίχνευσης και ταυτοποίησης αυτών των παθογόνων σε δείγματα τροφίμων μέσα από τη δημιουργία μίας microfluidic συσκευής που βασίζεται σε μοριακές τεχνικές (loop mediated isothermal amplification - LAMP) και με την οποία θα είναι δυνατό να πραγματοποιούνται μικροβιολογικές αναλύσεις σε δείγματα τροφίμων. Η μεθοδολογία περιελάμβανε τη διεξαγωγή μίας περιεκτικής βιβλιογραφικής ανασκόπησης για την απόκτηση γνώσεων σχετικά με τις υπάρχουσες μεθόδους ανίχνευσης παθογόνων βακτηρίων και τους περιορισμούς τους. Με βάση την ανασκόπηση, επιλέχθηκαν οι εξής τέσσερις συγκεκριμένες μέθοδοι ανίχνευσης για αξιολόγηση: η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), οι ανοσοαναλύσεις, οι βιοαισθητήρες και η αλληλούχιση επόμενης γενιάς (NGS).Στην παρούσα μελέτη δοκιμάστηκαν πρώτα 11 διαφορετικές μέθοδοι απομόνωσης DNA μικροοργανισμών και στη συνέχεια ταυτοποιήθηκαν με τις μοριακές τεχνικές που αναφέρονται (PCR- LAMP). Στη συνέχεια επιλέχθηκε ο συνδυασμός της in-house μεθόδου που αναφέρεται σε συνδυασμό με τη LAMP (όντας πιο ευαίσθητη και ταχεία μοριακή τεχνική από την PCR) ως βέλτιστη από πλευράς χρόνου-κόστους-ευαισθησίας, και τέλος συνδυάστηκε με μία 3D συσκευή microfluidic. Για την αξιολόγηση της απόδοσης αυτών των μεθόδων, χρησιμοποιήθηκαν τεχνητά μολυσμένα δείγματα τροφίμων, όπως μαρούλι, γάλα και κοτόπουλο ως μήτρες δοκιμής. Κάθε μέθοδος αξιολογήθηκε με βάση την ευαισθησία, την εξειδίκευσή της, την απαίτηση χρόνου, το κόστος και την ευκολία χρήσης της. Επιπρόσθετα, διερευνήθηκε η δυνατότητα αυτών των μεθόδων για τον εντοπισμό συγκεκριμένων παραγόντων λοιμογόνου δράσης και γονιδίων αντιμικροβιακής αντοχής που σχετίζονται με τα παθογόνα στόχους. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν διαφορετικές επιδόσεις μεταξύ των μεθόδων ανίχνευσης. Η PCR και η Nexr Generation Sequencing (NGS) παρουσίασαν υψηλή ευαισθησία και εξειδίκευση, επιτρέποντας την ακριβή ανίχνευση και ταυτοποίηση των παθογόνων στόχων. Οι 12 ανοσοδοκιμασίες έδειξαν καλή εξειδίκευση αλλά περιορισμένη ευαισθησία, ενώ οι βιοαισθητήρες προσέφεραν ταχεία ανίχνευση αλλά απαιτούσαν περαιτέρω βελτιστοποίηση για ενισχυμένη ευαισθησία. Συζητήθηκε επίσης η εφαρμογή αυτών των μεθόδων ανίχνευσης σε αναλυτικά εργαστήρια τροφίμων, συμπεριλαμβανομένων των απαιτήσεων εξοπλισμού, της διαθεσιμότητας αντιδραστηρίων και της σχέσης κόστους-αποτελεσματικότητας. Επιπλέον, δόθηκαν κατευθύνσεις για μελλοντική έρευνα, δίνοντας έμφαση στην ανάγκη για εκτεταμένη ποικιλία στελεχών και δειγμάτων, ολοκληρωμένη επικύρωση έναντι μεθόδων αναφοράς και διερεύνηση αυτοματισμού και ανάλυσης υψηλής απόδοσης. H παρούσα συγκριτική μελέτη παρέχει πολύτιμες γνώσεις σχετικά με τις μεθόδους ανίχνευσης της Salmonella Typhimurium, της Listeria monocytogenes και της Escherichia coli σε δείγματα τροφίμων. Τα ευρήματα συμβάλλουν στην ανάπτυξη βελτιωμένων στρατηγικών για την έγκαιρη και ακριβή ανίχνευση των τροφιμογενών παθογόνων, συνεισφέροντας τελικά στην ασφάλεια των τροφίμων και τη δημόσια υγεία. Απαιτείται περαιτέρω έρευνα για την αντιμετώπιση των περιορισμών που έχουν εντοπιστεί και για τη διερεύνηση νέων οδών για ανίχνευση σε πραγματικό χρόνο σε διάφορα τρόφιμα.