Μελέτες μεταβολομικής ανάλυσης με εφαρμογή στον αγροδιατροφικό τομέα

Abstract

The main purpose of this thesis was the study and thorough characterization of wine products using metabolomic analyses. Innovative, rapid, targeted and untargeted protocols of liquid and gas chromatography combined with mass spectrometry were applied to alcoholic fermentation grape must, wine and grape marc spirit, tsipouro, either to distinguish them in terms of authenticity and geographical origin or to study the metabolic biochemical pathways of various metabolites during the winemaking process. Different separation and sample preparation techniques were applied and, DOE experimental designs were created to optimize the extraction of volatile compounds from several substrates. More specifically, two LC-MS protocols, a targeted HILIC-MS/MS and an untargeted reversed phase UHPLC-TOF-MS method, were developed and applied to samples of Muscat of Alexandria grape musts of industrial alcoholic fermentation from wineries on the island of Lemnos, with the aim of studying the behavioral patterns of metabolites during fermentation and clarifying the complex enzymatic reactions that affect the quality of wines. Completion of the alcoholic fermentation grape must study, was achieved, using two more complementary GC-MS protocols, which allowed the identification of numerous volatile compounds of utmost importance for an aromatic variety such as Muscat of Alexandria, via HS-SPME, and non-volatile/semi-volatile via liquid injection after derivatization. Through the HS-SPME-GC-MS protocol, it was possible to monitor the behavior of 109 volatile metabolites (terpenes, terpenoids, alcohols, aldehydes, esters, norisoprenoids, etc.), while 69 metabolites (sugars, acids, amino acids, etc.) were monitored with the complementary GC-MS protocol with TMS derivatization. Regarding other wine products studied, the discrimination of Greek wines and Greek spirits, according their geographical origin and authenticity, was achieved by two HS-SPME-GC-MS methods based on a DOE for the optimal values of the SPME extraction factors, with the use of Definitive Screening and Modelling Designs and Response Surface Methodology, respectively. From these, it emerged that 100 volatile compounds were detected and semi-quantified in 70 PDO and PGI Greek white and red wines, while respectively 92 metabolites were identified in the 60 Greek spirits analyzed. Isoamyl alcohol was characteristic metabolite for distinguishing the Agiorgitiko variety, terpenic compounds highlighted Moschofilero as one of the most floral and aromatic Greek PDO varieties, while in Malagouzia high levels of hotrienol, nerol oxide, myrcenol and α-terpineol were detected. In the case of Greek spirits, the most important group of compounds were terpenoids, as the varieties of Muscat and Muscat of Alexandria predominate in the spirits of Northern Greece, to which aromatic substances are usually added, while tsikoudia from Crete, produced mainly from Soultanina and other native varieties, showed a higher concentration of 2-methylpropan-1-ol. In addition, a database of Greek foods with concentrations of metabolites from various classes of chemical compounds was created, including 26 different types of food and concentrations of many metabolites, as found from scientific publications, thus gathering a very large amount of information (more than 14000 entries) in an easy-to-use search tool for quantitative metabolite values in the literature, as there was no similar database containing metabolite concentrations in Greek foods but only with more general food properties.

Η παρούσα διατριβή είχε ως βασικό σκοπό τη μελέτη και τον ενδελεχή χαρακτηρισμό οινικών προϊόντων με τη χρήση μεταβολομικών αναλύσεων. Καινοτόμα, γρήγορα, στοχευμένα και μη στοχευμένα πρωτόκολλα υγρής και αέριας χρωματογραφίας σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας εφαρμόστηκαν σε γλεύκος αλκοολικής ζύμωσης, οίνο και τσίπουρο είτε για τη διάκριση τους ως προς την αυθεντικότητα και γεωγραφική προέλευση είτε για τη μελέτη των μεταβολικών βιοχημικών μονοπατιών ποικίλων μεταβολιτών κατά την οινοποιητική διαδικασία. Εφαρμόστηκαν διαφορετικές τεχνικές διαχωρισμού και προετοιμασίας του δείγματος και παράλληλα δημιουργήθηκαν σχεδιασμοί πειραμάτων DOE για βελτιστοποίηση της εκχύλισης πτητικών συστατικών από συγκεκριμένα υποστρώματα. Πιο συγκεκριμένα, αναπτύχθηκαν δύο πρωτόκολλα LC-MS, ένα στοχευμένης και ένα μη στοχευμένης μεταβολομικής ανάλυσης, μία μέθοδος HILIC-MS/MS και μία reversed phase UHPLC-TOF-MS και εφαρμόστηκαν σε δείγματα γλεύκους Μοσχάτου Αλεξανδρείας βιομηχανικής αλκοολικής ζύμωσης από οινοποιεία του νησιού της Λήμνου, με στόχο τη μελέτη των μοτίβων συμπεριφοράς των μεταβολιτών κατά τη ζύμωση και την αποσαφήνιση των πολύπλοκων ενζυμικών αντιδράσεων που επηρεάζουν την ποιότητα των οίνων. Η ολοκλήρωση της μελέτης του γλεύκους και της αλκοολικής ζύμωσης επετεύχθη με τη χρήση δύο ακόμη συμπληρωματικών πρωτοκόλλων GC-MS, τα οποία επέτρεψαν τη μέτρηση πτητικών συστατικών υψίστης σημασίας για μια αρωματική ποικιλία όπως το Μοσχάτο Αλεξανδρείας, μέσω HS-SPME και μη πτητικών/ημιπτητικών μέσω υγρής έγχυσης μετά από παραγωγοποίηση. Μέσω του πρωτοκόλλου HS-SPME-GC-MS κατέστη δυνατή η παρακολούθηση της συμπεριφοράς 109 πτητικών μεταβολιτών (τερπένια, τερπενοειδή, αλκοόλες, αλδεΰδες, εστέρες, νορισοπρενοειδή κ.λπ.), ενώ 69 μεταβολίτες (σάκχαρα, οξέα, αμινοξέα κ.λπ.) παρακολουθήθηκαν με το συμπληρωματικό πρωτόκολλο GC-MS με παραγωγοποίηση TMS. Όσον αφορά άλλα οινικά προϊόντα που μελετήθηκαν, η διάκριση ελληνικών οίνων και ελληνικών αποσταγμάτων ως προς τη γεωγραφική προέλευση και την αυθεντικότητά τους επετεύχθη με δύο μεθόδους HS-SPME-GC-MS βασισμένες σε σχεδιασμό πειραμάτων για τις βέλτιστες τιμές των παραγόντων της εκχύλισης SPME, με τη χρήση της Μεθοδολογίας Οριστικής Σχεδίασης Διαλογής και Επιφάνειας Απόκρισης, αντίστοιχα. Από αυτές προέκυψε ότι, 100 πτητικές ενώσεις ανιχνεύθηκαν και ημι-ποσοτικοποιήθηκαν σε 70 ΠΟΠ και ΠΓΕ ελληνικούς λευκούς και ερυθρούς οίνους, ενώ αντίστοιχα 92 μεταβολίτες εντοπίστηκαν στα 60 ελληνικά αποστάγματα που αναλύθηκαν. Η ισοαμυλική αλκοόλη ήταν χαρακτηριστική για τη διάκριση της ποικιλίας Αγιωργίτικο, οι τερπενικές ενώσεις ανέδειξαν το Μοσχοφίλερο ως μια από τις πιο ανθικές και αρωματικές ελληνικές ποικιλίες ΠΟΠ, ενώ στη Μαλαγουζιά ανιχνεύθηκαν υψηλά επίπεδα χοτριενόλης, οξείδιου της νερόλης, μυρκενόλη και α-τερπινεόλη. Στην περίπτωση των ελληνικών αποσταγμάτων, η σημαντικότερη κατηγορία ενώσεων ήταν τα τερπενοειδή, καθώς οι ποικιλίες του Μοσχάτου και Μοσχάτου Αλεξανδρείας δεσπόζουν στα αποστάγματα της Βορείου Ελλάδας, στα οποία συνήθως γίνεται και προσθήκη αρωματικών υλών, ενώ η τσικουδιά από την Κρήτη, παραγόμενη κυρίως από Σουλτανίνα και άλλες γηγενείς ποικιλίες, εμφάνισε μεγαλύτερη συγκέντρωση σε 2-μεθυλοπροπάν-1-όλη. Επιπρόσθετα, δημιουργήθηκε μία βάση δεδομένων ελληνικών τροφίμων με συγκεντρώσεις μεταβολιτών από διάφορες κατηγορίες χημικών ενώσεων, περιλάμβανε 26 διαφορετικούς τύπους τροφίμων για τα οποία αναφέρονταν συγκεντρώσεις πληθώρας μεταβολιτών, όπως έχουν βρεθεί από πίνακες επιστημονικών δημοσιεύσεων, συγκεντρώνοντας έτσι έναν πολύ μεγάλο όγκο πληροφοριών (περισσότερες από 14000 καταχωρήσεις) σε ένα εύχρηστο εργαλείο αναζήτησης ποσοτικών τιμών μεταβολιτών στη βιβλιογραφία, καθώς δεν υπήρχε παρόμοια βάση για ελληνικά τρόφιμα με συγκεντρώσεις μεταβολιτών παρά μόνο με γενικότερες ιδιότητες των τροφίμων.