The role of metacaspases and metacaspase-like proteins in Arabidopsis seed and root physiology

Abstract

Seeds evolved thousands of years ago in land plants; an adaptation that gives to plants a superior evolutionary advantage. Seeds enter a period of quiescence that can last hundreds of years to survive unfavorable environmental conditions. Seeds exhibit a high amount of protein and lipid content to be able to provide vital nutrients to the embryo after germination during the heterotrophic stage. Quality control (e.g., degradation of misfolded proteins) of these abundant proteins is a major challenge for seed survival and different forms of proteolysis play crucial parts in cells to maintain protein homeostasis. In addition, plants, as sessile organisms, need to respond to a wide range of environmental cues resulting to various abiotic and biotic stresses they face daily. For this reason, they have developed endogenous signals which coordinate their capabilities for growth and survival. However, how this quality control as well as this coordinated response to the environmental signals is achieved remains unclear. The aim of this thesis was to address these two research questions to delineate basic biological processes that will reveal their underlying mechanisms. This study consists of two chapters, one for each biological question: The first chapter addresses the role of metacaspase (MCA) family of cysteine-dependent proteases previously linked with programmed cell death (PCD), in seed physiology and protein quality control. The second chapter focuses on an endogenous peptide, a member of the family of plant elicitor peptides (PEPs), and how MCAs and the metacaspase-like protease known as separase are able to proteolytically process them in order to release them in the apoplast and get perceived from their corresponding receptors of neighboring cells. In Arabidopsis, there are nine MCAs, three of them comprise type I, while the rest are type II, depending on their structure. Previously in the Moschou lab, all six type II MCAs were ablated through CRISPR resulting in the generation of a sextuple metacaspase Arabidopsis mutant. Surprisingly, although MCAs are previously implicated in PCD pathways, in our sextuple mutant we did not observe alterations in PCD. Additionally, only mild developmental phenotypes were observed in seedlings and adult plants. In contrast, the sextuple mutant exhibited reduced seed longevity, indicating that MCAs might have a role in seed viability by regulating seed proteostasis through their association with the endoplasmic reticulum. The first chapter aimed to investigate the exact mechanism underlying the regulation of seed proteostasis, following a multidisciplinary approach of proteomics, imaging, and biochemistry. This study, in parallel with the post-doctoral researcher Dr Chen Liu of Moschou lab, showed that MCA-II mutant seeds are implicated with the restriction of the AAA ATPase CELL DIVISION CYCLE 48 (CDC48) at the endoplasmic reticulum to discard misfolded proteins, compromising seed storability. This is dependent on the cleavage of its adaptor, UBIQUITINATION REGULATORY X DOMAIN–CONTAINING 10 (PUX10), by MCAs that enables the shuttling of CDC48 between lipid droplets and the ER leading to the preservation of seed protease homeostasis by sustaining lipid droplet dynamics with spatiotemporal proteolysis. Removal of the PUX10 adaptor in MCA–II mutant, partially restores seed proteostasis, CDC48 localization, and lipid droplet dynamics rescuing seed longevity phenotype. Regarding chapter 2, there are 8 PROPEPs in the Arabidopsis PEP family, which are signal peptides categorized as damage-associated molecular patterns (DAMPs) and are considered as danger indicator peptides although they have been also linked with roles beyond plant immunity. Previously in the Moschou lab, by studying a separase mutant, was discovered that a distinct member of the PEP family in terms of its induction conditions as well as expression pattern, PROPEP7, is a potential target of the cysteine-dependent MCA-like protease separase. The aim of this chapter is to investigate the conditions of PROPEP7 proteolytic processing into PEP7 by both MCAs and separase, as well as the perception and downstream signalling cascade of this peptide in plant physiology and especially to root architecture, which is very important in nutrient uptake and avoidance of toxic compounds within the soil. To achieve this, I followed a molecular, imaging, and genetic approach. The understanding of this may provide new means and methods by which we can generate tougher plants that can surpass the increasingly challenging environmental conditions that threaten nowadays food security.

Η παραγωγή σπόρου είναι μία διαδικασία η οποία εξελίχθηκε πριν από χιλιάδες χρόνια και αποτελεί μια προσαρμογή που προσδίδει στα φυτά ένα σημαντικό εξελικτικό πλεονέκτημα. Οι σπόροι εισέρχονται σε μια περίοδο ηρεμίας ή λήθαργου που μπορεί να διαρκέσει από μερικές εβδομάδες έως και εκατοντάδες χρόνια, για να αποφευχθεί η φύτρωση σε μη ευνοϊκές συνθήκες για το φυτό. Επιπροσθέτως, οι σπόροι διαθέτουν έναν μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών και λιπιδίων, για να μπορέσει το έμβρυο να προμηθευτεί τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά στα πρώτα στάδια της ζωής του αμέσως μετά την φύτρωση, όπου εισέρχεται στο ετερότροφο στάδιο. Ο έλεγχος ποιότητας (π.χ. καταστροφή λάθος αναδιπλωμένων πρωτεϊνών) αυτού του μεγάλου αριθμού πρωτεϊνών αποτελεί μια μεγάλη πρόκληση για την επιβίωση του σπόρου. Για τον λόγο αυτό, η πρωτεόλυση έχει ζωτικό ρόλο στα κύτταρα με σκοπό την διατήρηση της πρωτεϊνικής ομοιόστασης (πρωτεόστασης). Παράλληλα, τα φυτά, ως ακίνητοι οργανισμοί, είναι αναγκασμένα καθημερινά να αποκρίνονται σε ένα ευρύ φάσμα περιβαλλοντικών ερεθισμάτων που μπορούν να προκαλέσουν βιοτικές ή αβιοτικές καταπονήσεις. Για τον λόγο αυτό έχουν αναπτύξει ενδογενή πεπτιδικά σήματα που συντονίζουν τις ιδιότητες τους μεταξύ ανάπτυξης και επιβίωσης. Πως όμως επιτυγχάνεται αυτός ο έλεγχος ποιότητας πρωτεϊνών καθώς επίσης και η συντονισμένη απόκριση στα περιβαλλοντικά σήματα παραμένει απροσδιόριστο. Ο στόχος της παρούσας διατριβής είναι η μελέτη των παραπάνω δύο ερευνητικών ερωτημάτων με αποτέλεσμα την αποσαφήνιση βασικών βιολογικών διεργασιών που θα αποκαλύψει τους μηχανισμούς ρύθμισής τους. Η παρούσα εργασία αποτελείται από δύο κεφάλαια, οπού το καθένα διερευνά ένα διαφορετικό βιολογικό ερώτημα. Το πρώτο κεφάλαιο επικεντρώνεται στον ρόλο των μετακασπασών (metacaspases), μια οικογένεια πρωτεασών εξαρτώμενων από κυστεΐνη οι οποίες προηγουμένως έχουν συσχετισθεί με τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (ΠΚΘ), στην φυσιολογία του σπόρου και στον έλεγχο ποιότητας πρωτεϊνών. Το δεύτερο κεφάλαιο επικεντρώνεται σε ένα ενδογενές πεπτίδιο που ανήκει στην οικογένεια PEP (plant elicitor peptides) και πως οι μετακασπάσες και μια όμοια πρωτεάση γνωστή ως σεπαράση (separase), μπορούν να το επεξεργαστούν πρωτεολυτικά με σκοπό την απελευθέρωση του στον αποπλάστη και την αναγνώριση του από τους σχετικούς υποδοχείς των γειτονικών κυττάρων. Στο φυτό Arabidopsis thaliana, η οικογένεια των μετακασπασών περιλαμβάνει εννέα μέλη, με τρία εξ αυτών να υπάγονται στον τύπο Ι και τις υπόλοιπες έξι στον τύπο ΙΙ, ανάλογα με τις πρωτεϊνικές επικράτειες που φέρουν. Προηγουμένως στο εργαστήριο Φυσιολογίας και Βιοτεχνολογίας Φυτών του καθηγητή Μόσχου, πραγματοποιήθηκε απαλοιφή όλων των μετακασπασών τύπου ΙΙ με την χρήση της τεχνολογίας CRISPR, οδηγώντας στη δημιουργία ενός εξαπλού μεταλλάγματος Arabidopsis. Παραδόξως, παρόλο που σε προηγούμενες έρευνες οι μετακασπάσες έχουν συσχετισθεί με μονοπάτια του ΠΚΘ, στο εξαπλό αυτό μετάλλαγμα δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές προς αυτή την κατεύθυνση. Επιπροσθέτως, παρατηρήθηκαν μόνο ασθενείς αναπτυξιακοί φαινότυποι στο στάδιο του σπορόφυτου (seedling) και στο ενήλικο στάδιο. Αντιθέτως, οι σπόροι του εξαπλού μεταλλάγματος παρουσίασε μειωμένη μακροζωία, υποδεικνύοντας ότι οι μετακασπάσες πιθανώς να έχουν κάποιο ρόλο στη βιωσιμότητα των σπόρων, ρυθμίζοντας τη πρωτεόσταση μέσω της σύνδεσής τους στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Ο στόχος του πρώτου κεφαλαίου είναι η μελέτη του μοριακού μηχανισμού της ρύθμισης της πρωτεόστασης των σπόρων, ακολουθώντας μια προσέγγιση που περιλαμβάνει γενετική, βιοαπεικονιστική καθώς επίσης και πρωτεομικές αναλύσεις. Αυτή η εργασία σε συνδυασμό με την δουλεία της μεταδιδακτορικής ερευνήτριας του εργαστηρίου, Dr Chen Liu, έδειξαν ότι οι σπόροι του εξαπλού μεταλλάγματος εμπλέκονται στον περιορισμό της AAA ATPase CELL DIVISION CYCLE 48 (CDC48) στο ενδοπλασματικό δίκτυο από την απόρριψη των λάθος αναδιπλωμένων πρωτεϊνών, θέτοντας σε κίνδυνο τη μακροζωία των σπόρων. Αυτό εξαρτάται από την πρωτεολυτική κοπή του οδηγού της CDC48, την ubiquitination regulatory X domain–containing 10 (PUX10), από τις μετακασπάσες. Αυτό οδηγεί στην ενεργοποίηση της μετακίνηση της CDC48 μεταξύ των σωμάτων ελαίων (oil bodies) και του ενδοπλασματικού δικτύου διατηρώντας έτσι την πρωτεόσταση των σπόρων μέσω της ρύθμισης του δυναμικού των σωμάτων ελαίων. Η αφαίρεση της PUX10 στο μετάλλαγμα της μετακασπάσης οδήγησε στην επαναφορά της πρωτεόστασης και της τοπολογίας της CDC48, και αντέστρεψε μερικώς τον φαινότυπο της μειωμένης μακροβιότητας των σπόρων.Όσον αφορά στο κεφάλαιο 2, υπάρχουν 8 PROPEPs στην οικογένεια PEP της Arabidopsis. Πρόκειται για πεπτιδικά σήματα της κατηγορίας damage-associated molecular patterns (DAMPs) χαρακτηρισμένα ως δείκτες κινδύνου για το φυτό, παρόλο που έχουν συσχετισθεί σε προηγούμενες έρευνες και με ρόλους πέρα από την φυτική άμυνα. Προηγουμένως στο εργαστήριο Φυσιολογίας και Βιοτεχνολογίας Φυτών του καθηγητή Μόσχου, η μελέτη ενός μεταλλάγματος σεπαράσης οδήγησε σε στοιχεία που υποδεικνύουν ότι ένα ξεχωριστό μέλος της οικογένειας PEP, όσον αφορά στο μοτίβο έκφρασης και στις συνθήκες ενεργοποίησης, πιθανώς να αποτελεί στόχο της σεπαράσης. Ο στόχος αυτού του κεφαλαίου είναι η διερεύνηση των συνθηκών πρωτεολυτικής επεξεργασίας του PROPEP7 από τις μετακασπάσες και την σεπαράση, το σηματοδοτικό μονοπάτι που ενεργοποιείται από την αντίληψη του πεπτιδίου αυτού καθώς επίσης και τον ρόλο του στην φυσιολογία του φυτού με έμφαση στη ρίζα. Για την επίτευξη του σκοπού αυτού, ακολούθησα προσεγγίσεις μοριακής βιολογίας, απεικόνισης και γενετικής. Η κατανόηση του φαινομένου αυτού πιθανώς να οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων μεθόδων για την δημιουργία πιο ανθεκτικών φυτών που θα μπορούν να ξεπεράσουν τις ολοένα και δυσμενέστερες περιβαλλοντικές συνθήκες που απειλούν σήμερα την επισιτιστική ασφάλεια.