Διερεύνηση της προστατευτικής δράσης της τοξίνης cholera-toxin του βακτηρίου Vibrio cholerae στην καρκινογένεση

Abstract

Tumor micro- and macroenvironment play important roles in the progression of preneoplastic lesions to neoplasia. More specifically, the interplay between the immune, endocrine and nervous systems, as well as the gut microbiome constitute crucial interactions during this process. The importance of the immune system and the microbiome is highlighted by the “hygiene hypothesis”, according to which antigenic stimuli received through the digestive tract by residents of underdeveloped or less developed countries at a young age, due to poor hygiene conditions, may potentially protect them from autoimmune diseases and allergies later in life. Experimental data support the notion that the “hygiene hypothesis” may also apply to carcinogenesis. In modern societies, the lack of antigenic stimuli, especially during the perinatal period and the first years of life, is likely to lead to disturbances in both gut microbiome and immune system that may contribute to the development of carcinogenesis.A disease that still exists in the underdeveloped countries, but has been eradicated from the developed ones is cholera, a diarrheal disease caused by the cholera toxin (CT) produced by the pathogenic bacterium Vibrio cholerae. CT consists of two subunits, CTA and CTB. CTA causes diarrhea, whereas both CTB and the holotoxin have strong immunosuppressive and immunomodulatory effects. The impact of CT on the regulation of the immune system, the bidirectional interaction between the immune system and the microbiome, as well as the association of both immune system and gut microbiome with cancer highlight the potential role of CT in carcinogenesis. The effect of CT on cancer has been studied in various cancer cell lines. Moreover, limited number of studies in animal models indicate a role of CT in reducing colorectal cancer, whereas recent epidemiological studies show an increase in the survival rates of patients with colorectal, prostate and breast cancer who along with their anticancer treatment were also vaccinated against cholera. The aim of the present study was to investigate whether early life CT consumption, before the onset of carcinogenesis, may suppress cancer in tissues distantly located from the gut. Additionally, the molecular mechanisms through which CT exerts its potential protective effect were explored.For this purpose, two experiments were performed; a long-term which lasted for 42 weeks and a short-term for 15 weeks. The first one was used to evaluate the outcome of carcinogenesis, whereas the second aimed to examine various factors within the microenvironment of the dysplastic/preneoplastic lesions as well as the changes CT administration might have induced on them. Female FVB/N mice were used for all experiments. CT was administered once a week for 4 consecutive weeks, starting at the age of 2 weeks. The carcinogen 7,12-dimethylbenzanthracene (DMBA) was administered for 6 consecutive weeks, 1 dose per week, starting at the age of 8 weeks. Based on the administration of CT and DMBA, the following experimental groups were designated: Control, CT, DMBA and DMBA+CT.The results of the long-term experiment revealed that the oral administration of CT at a young age and before the onset of carcinogenesis had a protective effect on the progression of the latter in tissues distantly located from the gastrointestinal system. Specifically, DMBA-treated mice primarily developed mammary, pulmonary and nonglandular stomach carcinomas. CT treatment resulted in: in the mammary gland, a decrease in the overall multiplicity; in the lung, a decrease in both overall (benign and malignant) and malignant tumor burden, and mean size of tumors; and in the stomach, a decrease in the incidence of malignancy. In addition, CT administration reduced the total number of malignant tumors and promoted the survival of mice.The results of the short-term experiment showed that CT administration did not prevent the formation of preneoplastic lesions, but it rather changed their environment, making it less favorable for their progression to neoplasia. CT treatment affected the expression of genes and proteins associated with carcinogenesis. The DMBA+CT group showed an increase in the expression of the Caspase-3 apoptosis marker in all three main organs (mammary, lung, stomach) that developed cancer during the long-term experiment, and a decrease in the Ki-67 cell proliferation marker only in the lung. In the same group, the following results were identified: in the mammary gland, a decrease in the expression of Her2, c-Myc and Snai2 oncogenes, and an increase in p21 tumor suppressor in the cell nucleus; in the lung, a decrease in Cyclin D1 in the epithelial cells; and in the stomach, a decrease in Vegfa angiogenic factor. Examining genes associated with both inflammation and carcinogenesis, in mice treated with DMBA and CT the following observations in gene expression levels were made: in the mammary gland, a decrease in Runx2, Stat3, and Id2; in the lung, an increase in Klf4; in the stomach, a decrease in Id2 and Runx3; and in the spleen, an increase in Runx, Snai2, Stat3, Id2 and Id3. The administration of CT also affected immune cells and factors. In the DMBA+CT group, a significant decrease in neutrophil population in the bloodstream, lymphoid organs, mammary gland and lung was observed, along with an increase in the active forms of macrophages and T helper cells. A decrease in the effector T cells in the spleen, coupled with an increase in both cytotoxic and regulatory T cells in the lymphoid tissues, were also identified. Moreover, in the same group, the following alterations in gene expression levels were found: in the spleen, an increase in Gata3 (Th2 cell marker), Il1b, Ifng, Il12 and Il10; in the mammary gland, a decrease in T-bet (Th1 cell marker), Rorc (Th17 cell marker), Ifng and Il10; in the lung, a decrease in Rorc, Il1b and Il10; and in the stomach, an increase in T-bet.Significant alterations were also identified in the gut microbiome. It was observed that bacteria of the Bacillus order, such as Lactobacilli, dominated the microbiome of mice treated with DMBA and CT, whereas the DMBA group displayed a higher abundance in the Clostridia order. PCoA analysis confirmed that the two groups had distinct microbiomes, as samples clustered together according to treatment. The key contributors to this separation were Lachnospiraceae in the DMBA group and Lactobacillaceae in the DMBA+CT group. In conclusion, it was demonstrated that the oral administration of CT in mice at the peri-weaning period is potent enough to suppress chemically-induced tumor burden with advancing age and promote survival. The beneficial outcome of CT was found to co-exist with long-term effects of CT on gut bacteria flora, immune system profile and gene expression levels in cancer-prone tissues.

Κατά την εξέλιξη των προνεοπλασματικών αλλοιώσεων σε νεοπλασία σημαντικό ρόλο παίζει εκτός από το μικροπεριβάλλον του όγκου και το μακροπεριβάλλον, και πιο συγκεκριμένα η αλληλεπίδραση ανάμεσα στο ανοσοποιητικό, το ενδοκρινικό και το νευρικό σύστημα, καθώς και στο μικροβίωμα του εντέρου. Τη σπουδαιότητα του ανοσοποιητικού συστήματος και του μικροβιώματος ενισχύει η θεωρία των «συνθηκών υγιεινής», σύμφωνα με την οποία τα αντιγονικά ερεθίσματα που λαμβάνουν δια της πεπτικής οδού οι κάτοικοι των αναπτυσσόμενων ή λιγότερο αναπτυγμένων χωρών σε νεαρή ηλικία, εξαιτίας των κακών συνθηκών υγιεινής, είναι πιθανό να τους προστατεύουν από αυτοάνοσα νοσήματα και αλλεργίες αργότερα στη ζωή τους. Πειραματικά δεδομένα ενισχύουν την άποψη ότι η θεωρία των «συνθηκών υγιεινής» μπορεί να ισχύει και στην περίπτωση της καρκινογένεσης. Στις σύγχρονες κοινωνίες, η έλλειψη αντιγονικών ερεθισμάτων, κυρίως κατά την περιγεννητική περίοδο και τα πρώτα χρόνια της ζωής του ανθρώπου, είναι πιθανόν να οδηγεί σε διαταραχή τόσο της βακτηριακής χλωρίδας του εντέρου όσο και του ανοσοποιητικού συστήματος, τα οποία συμβάλλουν στην ανάπτυξη της καρκινογένεσης. Ένα νόσημα που υπάρχει ακόμη στις αναπτυσσόμενες χώρες, αλλά έχει εξαλειφθεί από τις αναπτυγμένες, είναι η διαρροϊκή νόσος χολέρα που οφείλεται στην τοξίνη cholera toxin (CT) του βακτηρίου Vibrio cholerae. Η τοξίνη αποτελείται από δύο υπομονάδες, τη CTA και τη CTB. Η CTA προκαλεί τη διάρροια, ενώ τόσο η CTB όσο και ολόκληρη η τοξίνη CT έχουν ισχυρή ανοσοενισχυτική και ανοσορρυθμιστική δράση. Η επίδραση αυτή της CT στη ρύθμιση του ανοσοποιητικού συστήματος, η αμφίδρομη αλληλεπίδραση του ανοσοποιητικού με το μικροβίωμα καθώς και η συσχέτιση του ανοσοποιητικού και της βακτηριακής χλωρίδας του εντέρου με τον καρκίνο ανέδειξαν τον πιθανό ρόλο της CT στην καρκινογένεση. Η επίδραση της CT στον καρκίνο έχει μελετηθεί σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Περιορισμένος αριθμός ερευνών σε πειραματόζωα-πρότυπα καταδεικνύουν το ρόλο της CT στη μείωση του καρκίνου του παχέος εντέρου, ενώ πρόσφατες επιδημιολογικές μελέτες δείχνουν αύξηση του προσδόκιμου επιβίωσης ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου, του προστάτη και του μαστού οι οποίοι παράλληλα με την αντικαρκινική αγωγή χρειάστηκε να εμβολιαστούν κατά της χολέρας. Βασικός στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να διερευνήσει εάν η χορήγηση της CT από το στόμα σε νεαρή ηλικία και πριν την έναρξη της καρκινογένεσης μπορεί να λειτουργήσει προστατευτικά στην εξέλιξη της τελευταίας σε ιστούς απομακρυσμένους από το γαστρεντερικό σύστημα. Επιπλέον, διερευνήθηκαν οι μηχανισμοί μέσω των οποίων η CT ασκεί την πιθανή προστατευτική της δράση.Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν δύο πειραματισμοί, ένας μακροπρόθεσμος διάρκειας 42 εβδομάδων και ένας βραχυπρόθεσμος διάρκειας 15 εβδομάδων. Ο πρώτος χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί το αποτέλεσμα της καρκινογένεσης, ενώ ο δεύτερος για να εξεταστούν διάφοροι παράγοντες στο μικροπεριβάλλον των δυσπλαστικών/ προνεοπλασματικών αλλοιώσεων και οι μεταβολές που ενδεχομένως θα προκαλούσε σε αυτούς η χορήγηση της CT. Για τους πειραματισμούς χρησιμοποιήθηκαν θηλυκοί ποντικοί της φυλής FVB/N. Η χορήγηση της CT γινόταν 1 φορά την εβδομάδα για 4 συνεχόμενες εβδομάδες, ξεκινώντας από την ηλικία των 2 εβδομάδων. Το καρκινογόνο 7,12-διμεθυλοβενζο ανθρακένιο [dimethylbenzanthracene (DMBA)] χορηγούνταν για 6 συνεχόμενες εβδομάδες, 1 δόση ανά εβδομάδα, ξεκινώντας από την ηλικία των 8 εβδομάδων. Με βάση τη χορήγηση της CT και του DMBA δημιουργήθηκαν οι παρακάτω πειραματικές ομάδες: Μάρτυρες, CT, DMBA και DMBA+CT. Τα αποτελέσματα του μακροπρόθεσμου πειραματισμού έδειξαν ότι η χορήγηση της CT από το στόμα σε νεαρή ηλικία και πριν την έναρξη της καρκινογένεσης είχε προστατευτική δράση στην εξέλιξη της τελευταίας σε ιστούς απομακρυσμένους από το γαστρεντερικό σύστημα. Πιο συγκεκριμένα, οι ποντικοί που έλαβαν DMBA εμφάνισαν κυρίως καρκίνο στο μαστό, στον πνεύμονα και στη μη αδενική μοίρα του στομάχου. Η χορήγηση της CT οδήγησε στο μαστό σε μείωση του συνολικού αριθμού των καρκινικών όγκων, στον πνεύμονα σε μείωση του συνολικού αριθμού των όγκων (καλοήθεις και κακοήθεις) και μείωση του συνολικού αριθμού και του μέσου μεγέθους των καρκινικών όγκων, και στην οισοφαγική μοίρα του στομάχου σε μείωση του ποσοστού εμφάνισης καρκίνου και του συνολικού αριθμού των καρκινικών όγκων. Επιπρόσθετα, η χορήγηση της CT μείωσε το συνολικό αριθμό όλων των καρκινικών όγκων και αύξησε το ποσοστό επιβίωσης των ποντικών. Τα αποτελέσματα του βραχυπρόθεσμου πειραματισμού έδειξαν ότι η χορήγηση της CT δεν εμπόδισε τη δημιουργία προνεοπλασματικών αλλοιώσεων, αλλά πιθανώς τροποποίησε το περιβάλλον των προνεοπλασματικών αλλοιώσεων εμποδίζοντας με τον τρόπο αυτό την εξέλιξή τους σε νεοπλασία. Η χορήγηση της CT επηρέασε την έκφραση χαρακτηριστικών γονιδίων και πρωτεϊνών που σχετίζονται με την καρκινογένεση. Η ομάδα DMBA+CT παρουσίασε αύξηση της έκφρασης του δείκτη απόπτωσης κασπάση 3 και στα τρία κύρια όργανα (μαστός, πνεύμονας, στόμαχος) που εμφάνισαν καρκίνο κατά το μακροπρόθεσμο πειραματισμό και μείωση του δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων Ki-67 μόνο στον πνεύμονα. Στην ίδια ομάδα παρατηρήθηκαν: στο μαστό μείωση της έκφρασης των ογκογονιδίων Her2, c-Myc και Snai2 και αύξηση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p21 στον πυρήνα των κυττάρων, στον πνεύμονα μείωση της Cyclin D1 στα κύτταρα του επιθηλίου, και στην οισοφαγική μοίρα του στομάχου μείωση του αγγειογενετικού παράγοντα Vegfa. Από τη μελέτη κλασσικών γονιδίων που σχετίζονται με τη φλεγμονή και την καρκινογένεση, στους ποντικούς που έλαβαν DMBA και CT παρατηρήθηκε: στο μαστό μείωση των Runx2, Stat3, και Id2, στον πνεύμονα αύξηση του Klf4, στην οισοφαγική μοίρα του στομάχου μείωση των Id2 και Runx3, και στο σπλήνα αύξηση των Runx, Snai2, Stat3, Id2 και Id3. Η χορήγηση της CT επηρέασε, επίσης, κύτταρα και παράγοντες του ανοσοποιητικού συστήματος. Στην ομάδα DMBA+CT παρατηρήθηκε σημαντική μείωση του πληθυσμού των ουδετερόφιλων στην κυκλοφορία του αίματος, στα λεμφικά όργανα, στο μαστό και στον πνεύμονα, αύξηση των ενεργών μορφών των μακροφάγων και των βοηθητικών Τ-λεμφοκυττάρων και μείωση των δραστικών Τ-λεμφοκυττάρων στο σπλήνα, καθώς και αύξηση των κυτταροτοξικών και των ρυθμιστικών Τ-λεμφοκυττάρων στους λεμφικούς ιστούς. Στους ποντικούς της ίδιας ομάδας παρατηρήθηκε, επίσης: στο σπλήνα αύξηση της έκφρασης του Gata3 (δείκτης κυττάρων Th2) και των κυτταροκινών Il1b, Ifng, Il12 και Il10, στο μαστό μείωση της έκφρασης του T-bet (δείκτης των κυττάρων Th1), του Rorc (δείκτης των κυττάρων Th17) και των κυτταροκινών Ifng και Il10, στον πνεύμονα μείωση του Rorc και των κυτταροκινών Il1b και Il10, και στην οισοφαγική μοίρα του στομάχου αύξηση του T-bet. Σημαντικές μεταβολές εντοπίστηκαν και στη βακτηριακή χλωρίδα του εντέρου. Στους ποντικούς που έλαβαν DMBA και CT βρέθηκε να επικρατούν κυρίως βακτήρια της τάξης των βακίλων, όπως οι λακτοβάκιλλοι, ενώ στην ομάδα DMBA ήταν αυξημένος ο πληθυσμός βακτηρίων της τάξης των κλωστριδίων. Η ανάλυση PCoA επιβεβαίωσε ότι οι ποντικοί είχαν διαφορετική βακτηριακή χλωρίδα, καθώς βρέθηκαν να ομαδοποιούνται με βάση το εάν έλαβαν ή όχι CT. Τα βακτήρια που συνέβαλαν κυρίως σε αυτό το διαχωρισμό ήταν στην ομάδα DMBA τα Lachnospiraceae και στην ομάδα DMBA+CT τα Lactobacillaceae. Συμπερασματικά, η χορήγηση της CT σε πολύ νεαρή ηλικία και πριν την έναρξη της καρκινογένεσης μείωσε την εμφάνιση καρκίνου στην οισοφαγική μοίρα του στομάχου καθώς και σε ιστούς απομακρυσμένους από το γαστρεντερικό σύστημα, όπως το μαστό και τον πνεύμονα, και αύξησε το ποσοστό επιβίωσης των ποντικών. Η CT δεν κατέστειλε την καρκινογένεση παρεμποδίζοντας την εμφάνιση προνεοπλασματικών αλλοιώσεων, αλλά πιθανώς άλλαξε το περιβάλλον τους καθιστώντας το λιγότερο ευνοϊκό για την εξέλιξη τους σε νεοπλασία. Η δράση αυτή της CT συσχετίσθηκε κυρίως με μείωση του αριθμού των ουδετερόφιλων, αύξηση της απόπτωσης των κυττάρων, αλλαγές στην έκφραση γονιδίων και μεταβολές στη βακτηριακή χλωρίδα του εντέρου.