Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων με την αξιοποίηση νανοσωματιδίων

Abstract

This PhD dissertation is a contribution to the field of Analytical/Bioanalytical Chemistry and especially to the development and analytical applications of chemical sensors/biosensors exploiting nanoparticles as labels/reporters. The dissertation consists of two sections, the General Section and the Experimental Section. The General Section (Chapter 1) begins by presenting the central axes on which the development of numerous methods for the identification and quantification of various analytes (from simple ions to macromolecules and macromolecular complexes) in a variety of samples is based. It then focuses on the ways in which specific molecular recognition of the analyte in a sample can be achieved and connected to signal generation, a process that is core to the development (invention, experimental study and analytical application) of chemical sensors/biosensors. The principles of immunochemical analysis methods and DNA / RNA hybridization methods are described. Also, the polymerase chain reaction (PCR) is presented as a technique for exponential amplification of specific nucleic acid sequences. To produce a signal, it is necessary to use suitable detectors. The choice of label affects the detectability of analytical methods and sensors. The characteristic optical and catalytic properties of gold nanoparticles (AuNPs) are described in particular, from where their various applications in Analytical/Bioanalytical Chemistry originate. These properties constitute the rationale for the fruitful encounter of the field of Analytical/Bioanalytical Chemistry with Nanotechnology. The most widely used methods for preparing AuNPs are also presented. Representative examples of analytical methods based on the properties of AuNPs are then described. The methods have been chosen to cover a variety of analytes and samples, as well as to suggest ways of thinking about the utilization of other types of nanoparticles. Following, the description of dry-reagent lateral flow chemical sensors with an emphasis on their architecture, functional aspects, and advantages is reported. The General Section closes by elaborating on the phenomenon of macromolecular crowding and its diverse effects on the structure and functionality of biomacromolecules. Also, the ways of exploiting the phenomenon of macromolecular crowding for the development of analytical reagents and methods are presented. The Experimental Section (Chapter 2) describes, for the first time in the scientific literature, the development of DNA biosensors for the molecular traceability of the varietal origin of olive oil and their application to DNA samples of olive leaves and olive oil. The identification of varieties is based on the detection of a series of single nucleotide changes in DNA (single nucleotide polymorphisms, SNPs). In addition, the developed biosensors have the following important features: (a) They are dry-reagent strip-type sensors with the analyte recognition and signal generation reagents integrated, so their use is simple. (b) The signal is detected with the naked eye so there is no need for expensive equipment. (c) They are multi-analyte sensors, i.e. they enable the simultaneous detection of several DNA analytes/alleles. The method for the identification of the varietal origin of the olive oil includes: (i) Multiplex PCR (70 min). (ii) Multiple genotyping reaction (15 min) for eight alleles. (iii) Direct application of the products to the DNA biosensors where the presence or absence of eight alleles in the form of colored spots is detected in 20 min. The combination of the spots reveals the identity of the olive variety. Simplicity, practicality, portability and low cost are important advantages of the proposed method compared to other molecular techniques. Chapters 3 and 4 of the Experimental Section focus on immunochemical sensors of the dry-reagent strip format, where the recognition of the analyte is carried out using specific antibodies, while the signal generation is achieved by the utilization of colored particles, mainly gold nanoparticles. The most important challenge in this field is to improve the detectability of sensors without affecting their simplicity and practicality. The most commonly applied ways to improve detectability are based on the design and application of new probes to label the antibodies, that is, either new nanoparticles or enzymes in combination with a variety of substrates. In contrast to the above methods, this doctoral dissertation exploits the phenomenon of macromolecular crowding to improve detectability. A key feature of macromolecular crowding is the decrease of the volume of water accessible to various molecules, particularly macromolecules and particles. In the crowded microenvironment, the effective concentration of any reactive macromolecules is higher than their expected, based on total volume, molarity. The diffusion coefficients of macromolecules decrease as the extent of crowding increases. In addition, there are many weak interactions that affect the final behavior of the system and add to its complexity. The direction and magnitude of the effect can only be estimated experimentally and cannot be predicted by generalized models. In Chapter 3, the effect of macromolecular crowding on the detectability of immunosensors was demonstrated using two of the most widely established immunosensors worldwide, namely the immunosensors for the detection of the nucleocapsid protein of SARS-CoV-2 (which causes the disease COVID-19) and the detection of Strep-A antigen (associated with pharyngitis and other diseases). For direct demonstration of improved detectability, macromolecular crowding agents were applied directly to commercially available immunosensors that were already optimized in terms of reagents and conditions. In the presence of water-soluble macromolecular crowding agents, a 5-10-fold improvement in the detectability of the immunosensors was achieved. The improvement is attributed to the fact that exposure of antibodies and nanoparticle conjugates to the macromolecular crowding environment, while simultaneously moving through the dense network of membrane pores (due to capillary action), promotes the interactions responsible for analyte recognition and signal generation. In Chapter 4, the macromolecular crowding effect is exploited to improve the detectability of dry-reagent strip-type immunosensors for allergens. Allergies constitute a major public health challenge and testing for allergenic substances in food is vital for prevention/protection of susceptible individuals. Testing is based on the ability of analytical methods to detect low levels of allergens in food samples. In the present work, the effect of macromolecular crowding on the detectability of dry-reagent strip-type immunosensors for peanut allergen was investigated. The effect of 14 water-soluble crowding polymers of different molecular masses and different concentrations on the detectability of the immunosensor was investigated. Overall, the results show that macromolecular crowding agents, at optimal concentrations, cause a significant improvement in the detection capability of immunosensors through signal enhancement without increasing non-specific binding. An approximately 10-fold improvement in detectability of the immunosensor was achieved. The most important aspect of the study is that the improvement in detectability is achieved without affecting the simplicity and practicality of the analyses. The proposed approach does not replace other ways of improving detectability, which are based on the use of new labels, but is proposed as an additional and complementary way to improve detectability through a different mechanism.Because biomacromolecular interactions play a fundamental functional role in all types of biosensors, both for the molecular recognition of the analyte and for converting the recognition event into a detectable signal (e.g., optical, electrochemical), it is expected that the proposed strategy of improving detection capability by exploiting macromolecular crowding agents will find applications in a variety of other biosensors and analytical devices and/or analytical methods beyond dry-reagent strip-type immunosensors.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποτελεί συμβολή στο πεδίο της Αναλυτικής/Βιοαναλυτικής Χημείας και ιδιαίτερα στην ανάπτυξη και τις αναλυτικές εφαρμογές των χημικών αισθητήρων/βιοαισθητήρων αξιοποιώντας τα νανοσωματίδια ως ιχνηθέτες/σηματοδότες. Η διδακτορική διατριβή απαρτίζεται από δύο μέρη, το Γενικό Μέρος και το Πειραματικό Μέρος. Το Γενικό Μέρος (Κεφάλαιο 1) ξεκινάει παρουσιάζοντας τους κεντρικούς άξονες στους οποίους βασίζεται η ανάπτυξη πληθώρας μεθόδων ταυτοποίησης και ποσοτικού προσδιορισμού διαφόρων αναλυτών (από απλά ιόντα μέχρι μακρομόρια και μακρομοριακά σύμπλοκα) σε ποικιλία δειγμάτων. Στη συνέχεια επικεντρώνεται στους τρόπους με τους οποίους μπορεί να επιτευχθεί η ειδική μοριακή αναγνώριση του αναλύτη σε ένα δείγμα και η διασύνδεσή της με την παραγωγή σήματος, διαδικασία που αποτελεί τον πυρήνα για την ανάπτυξη (επινόηση, πειραματική μελέτη και αναλυτική εφαρμογή) των χημικών αισθητήρων/βιοαισθητήρων. Περιγράφονται οι αρχές των ανοσοχημικών μεθόδων ανάλυσης και των μεθόδων υβριδοποίησης DNA/RNA. Επίσης, παρουσιάζεται η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) ως τεχνική εκθετικής ενίσχυσης ειδικών αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων. Για την παραγωγή σήματος, είναι αναγκαία η χρησιμοποίηση κατάλληλων ιχνηθετών. Η επιλογή του ιχνηθέτη επηρεάζει την ανιχνευσιμότητα των αναλυτικών μεθόδων και των αισθητήρων. Περιγράφονται, πιο συγκεκριμένα, οι χαρακτηριστικές οπτικές και καταλυτικές ιδιότητες των νανοσωματιδίων χρυσού (AuNPs) από όπου πηγάζουν οι ποικίλες εφαρμογές τους στην Αναλυτική/Βιοαναλυτική Χημεία. Οι ιδιότητες αυτές είναι η αιτία για τη γόνιμη συνάντηση του πεδίου της Αναλυτικής/Βιοαναλυτικής Χημείας με τη Νανοτεχνολογία. Επίσης παρουσιάζονται οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες μέθοδοι παρασκευής νανοσωματιδίων χρυσού. Έπειτα περιγράφονται αντιπροσωπευτικά παραδείγματα αναλυτικών μεθόδων που βασίζονται στις ιδιότητες των AuNPs. Οι μέθοδοι έχουν επιλεγεί έτσι ώστε να καλύπτουν ποικιλία αναλυτών και δειγμάτων, καθώς και να υποδεικνύουν τρόπους σκέψης για την αξιοποίηση και άλλων τύπων νανοσωματιδίων. Ακολουθεί η περιγραφή των χημικών αισθητήρων τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων με έμφαση στην αρχιτεκτονική τους, τους τρόπους λειτουργίας και τα πλεονεκτήματά τους. Το Γενικό Μέρος κλείνει με την κάλυψη του φαινομένου του μακρομοριακού συνωστισμού και των ποικίλων επιπτώσεών του στη δομή και τη λειτουργικότητα των βιομακρομορίων. Επίσης, παρουσιάζονται και οι τρόποι αξιοποίησης του φαινομένου του μακρομοριακού συνωστισμού για την ανάπτυξη αναλυτικών αντιδραστηρίων και μεθόδων. Στο Πειραματικό Μέρος (Κεφάλαιο 2) περιγράφεται, για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία, η ανάπτυξη βιοαισθητήρων DNA για τη μοριακή ιχνηλασιμότητα της ποικιλιακής προέλευσης του ελαιολάδου και η εφαρμογή τους σε δείγματα DNA φύλλων ελιάς και ελαιολάδου. Η ταυτοποίηση των ποικιλιών βασίζεται στην ανίχνευση σειράς μονονουκλεοτιδικών αλλαγών στο DNA (μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί, Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs). Επιπλέον, οι βιοαισθητήρες που αναπτύχθηκαν έχουν τα εξής σημαντικά χαρακτηριστικά: (α) Είναι αισθητήρες τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων με ενσωματωμένα τα αντιδραστήρια αναγνώρισης του αναλύτη και παραγωγής σήματος, οπότε η χρήση τους είναι απλή. (β) Το σήμα ανιχνεύεται με γυμνό μάτι οπότε δεν υπάρχει ανάγκη για δαπανηρό εξοπλισμό. (γ) Είναι πολυαναλυτικοί αισθητήρες, δηλαδή καθιστούν εφικτή την ταυτόχρονη ανίχνευση πολλών αναλυτών/αλληλίων DNΑ. Η μέθοδος για την ταυτοποίηση της ποικιλιακής προέλευσης του ελαιολάδου περιλαμβάνει: (i) Πολλαπλή PCR (70 min). (ii) Πολλαπλή αντίδραση γονοτύπησης (15 min) για οκτώ αλλήλια. (iii) Απευθείας εφαρμογή των προϊόντων στους βιοαισθητήρες DNA όπου ανιχνεύεται σε 20 min η παρουσία ή μη οκτώ αλληλίων με τη μορφή έγχρωμων κηλίδων των οποίων ο συνδυασμός αποκαλύπτει την ταυτότητα της ποικιλίας της ελιάς. Η απλότητα, η πρακτικότητα, η φορητότητα και το χαμηλό κόστος είναι σημαντικά πλεονεκτήματα της προτεινόμενης μεθόδου σε σχέση με άλλες μοριακές τεχνικές. Τα Κεφάλαια 3 και 4 του Πειραματικού Μέρους επικεντρώνονται στους ανοσοχημικούς αισθητήρες τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων, όπου η αναγνώριση του αναλύτη πραγματοποιείται με χρήση ειδικών αντισωμάτων, ενώ η παραγωγή σήματος επιτυγχάνεται με την αξιοποίηση έγχρωμων σωματιδίων, κυρίως νανοσωματιδίων χρυσού. Η πιο σημαντική πρόκληση στο πεδίο αυτό είναι η βελτίωση της ανιχνευσιμότητας των αισθητήρων χωρίς να επηρεάζεται η απλότητα και η πρακτικότητά τους. Οι πιο συχνά εφαρμοζόμενοι τρόποι βελτίωσης της ανιχνευσιμότητας βασίζονται στον σχεδιασμό και την εφαρμογή νέων ιχνηθετών για επισήμανση των αντισωμάτων, δηλαδή, είτε νέων νανοσωματιδίων είτε ενζύμων σε συνδυασμό με ποικιλία υποστρωμάτων. Σε αντίθεση με τους παραπάνω τρόπους, η παρούσα διδακτορική διατριβή αξιοποιεί το φαινόμενο του μακρομοριακού συνωστισμού για τη βελτίωση της ανιχνευσιμότητας. Κύριο χαρακτηριστικό του μακρομοριακού συνωστισμού είναι ο περιορισμός του όγκου του νερού που είναι προσβάσιμος στα άλλα μόρια, ιδιαίτερα στα μεγαλομόρια και στα σωματίδια. Στο πολυσύχναστο μικροπεριβάλλον, η αποτελεσματική συγκέντρωση οποιονδήποτε αντιδρώντων μακρομορίων είναι υψηλότερη από την αναμενόμενη, με βάση τον ολικό όγκο, μοριακότητά τους. Οι συντελεστές διάχυσης των μακρομορίων μειώνονται καθώς αυξάνεται η έκταση του συνωστισμού. Επιπλέον, υπάρχει πληθώρα ασθενών αλληλεπιδράσεων που επηρεάζουν την τελική συμπεριφορά του συστήματος και προσθέτουν στην πολυπλοκότητά του. Η κατεύθυνση και το μέγεθος της επίδρασης εκτιμώνται μόνο πειραματικά και δεν μπορούν να προβλεφθούν με γενικευμένα μοντέλα. Στο Κεφάλαιο 3 αποδείχθηκε η επίδραση του μακρομοριακού συνωστισμού στην ανιχνευσιμότητα των ανοσοαισθητήρων χρησιμοποιώντας δύο από τους πιο ευρέως καθιερωμένους ανοσοαισθητήρες, παγκοσμίως, δηλαδή τους ανοσοαισθητήρες για την ανίχνευση της πρωτεΐνης νουκλεοκαψιδίου του SARS-CoV-2 (που προκαλεί τη νόσο COVID-19) και την ανίχνευση του αντιγόνου Strep-A (που σχετίζεται με τη φαρυγγίτιδα και άλλες ασθένειες). Για άμεση απόδειξη της βελτίωσης της ανιχνευσιμότητας, οι παράγοντες μακρομοριακού συνωστισμού εφαρμόστηκαν απευθείας στους εμπορικά διαθέσιμους ανοσοαισθητήρες που ήταν ήδη βελτιστοποιημένοι ως προς τα αντιδραστήρια και τις συνθήκες. Παρουσία υδατοδιαλυτών παραγόντων μακρομοριακού συνωστισμού επετεύχθη βελτίωση της ανιχνευσιμότητας των ανοσοαισθητήρων κατά 5-10 φορές. Η βελτίωση αποδίδεται στο γεγονός ότι η έκθεση των αντισωμάτων και των συζευγμάτων των νανοσωματιδίων στο περιβάλλον μακρομοριακού συνωστισμού, ενώ παράλληλα κινούνται μέσω του πυκνού δικτύου των πόρων της μεμβράνης (λόγω δράσης τριχοειδών δυνάμεων), προάγει τις αλληλεπιδράσεις που είναι υπεύθυνες για την αναγνώριση του αναλύτη και την παραγωγή σήματος.Στο Κεφάλαιο 4 αξιοποιείται το φαινόμενο του μακρομοριακού συνωστισμού για τη βελτίωση της ανιχνευσιμότητας των ανοσοαισθητήρων τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων για αλλεργιογόνα. Οι αλλεργίες αποτελούν μεγάλη πρόκληση για τη δημόσια υγεία και ο έλεγχος για την ύπαρξη αλλεργιογόνων ουσιών στα τρόφιμα είναι ζωτικής σημασίας για την πρόληψη/προστασία των ευαίσθητων ατόμων. Ο έλεγχος βασίζεται στην ικανότητα των αναλυτικών μεθόδων να ανιχνεύουν χαμηλά επίπεδα αλλεργιογόνων σε δείγματα τροφίμων. Στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε η επίδραση του μακρομοριακού συνωστισμού στην ανιχνευσιμότητα των ανοσοαισθητήρων τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων για το αλλεργιογόνο των φιστικιών. Εξετάστηκε η επίδραση 14 υδατοδιαλυτών πολυμερών συνωστισμού διαφορετικών μοριακών μαζών και διαφορετικών συγκεντρώσεων στην ανιχνευσιμότητα του ανοσοαισθητήρα. Συνολικά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι μακρομοριακοί παράγοντες συνωστισμού, σε βέλτιστες συγκεντρώσεις, προκαλούν σημαντική βελτίωση στην ανιχνευτική ικανότητα των ανοσοαισθητήρων μέσω ενίσχυσης σήματος χωρίς αύξηση της μη ειδικής δέσμευσης. Επιτεύχθηκε βελτίωση στην ανιχνευσιμότητα του ανοσοαισθητήρα κατά 10 φορές περίπου. Η πιο σημαντική πτυχή της μελέτης είναι ότι η βελτίωση της ανιχνευσιμότητας επιτυγχάνεται χωρίς να επηρεάζεται η απλότητα και η πρακτικότητα των αναλύσεων. Η μέθοδος δεν αντικαθιστά τους άλλους τρόπους βελτίωσης της ανιχνευσιμότητας, οι οποίοι βασίζονται στη χρήση νέων ιχνηθετών, αλλά προτείνεται ως μια πρόσθετη και συμπληρωματική οδός για τη βελτίωση της ανιχνευσιμότητας μέσω διαφορετικού μηχανισμού.Επειδή οι βιομακρομοριακές αλληλεπιδράσεις έχουν θεμελιώδη λειτουργικό ρόλο σε όλους τους τύπους των βιοαισθητήρων, τόσο για τη μοριακή αναγνώριση του αναλύτη όσο και για τη μετατροπή της αναγνώρισης σε ανιχνεύσιμο σήμα (π.χ. οπτικό, ηλεκτροχημικό), αναμένεται ότι η προτεινόμενη στρατηγική για τη βελτίωση της ανιχνευτικής ικανότητας με την αξιοποίηση παραγόντων μακρομοριακού συνωστισμού θα βρει εφαρμογές σε ποικιλία άλλων βιοαισθητήρων και αναλυτικών συσκευών ή/και αναλυτικών μεθόδων πέρα από τους ανοσοαισθητήρες τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων.