Preoperative radiotherapy in rectal cancer and immune response

Abstract

Background-Introduction: Neoadjuvant radiotherapy (RT) is a primary therapeutic modality for the treatment of locally advanced rectal cancer. Recent advances in immunotherapy for rectal cancer suggest that the immune system plays a significant role in the control of this malignancy. Experimental research has demonstrated that RT has both immunosuppressive and immunostimulatory properties. Specifically for rectal cancer, a number of studies have demonstrated a direct effect of RT and chemo-radiotherapy (CRT) on immune checkpoint molecules expression by cancer cells, and on the quantity and quality of lymphocytes and monocytes invading irradiated rectal cancer tissue. Optimal combination of immunotherapy with RT is still under investigation. Materials and Methods: Retrospective clinical study: Thirty-three (33) rectal adenocarcinoma patients treated with preoperative long-course CRT (lcRT) were analyzed. The primary objective was to assess the effects of CRT on the lymphocyte counts (LC) of the peripheral blood, and the potential impact of CRT-induced lymphopenia on tumor response and patient prognosis. Prospective clinical-laboratory study: An ELISA assay was performed to analyze the IFNβ plasma levels of patients with rectal adenocarcinoma, before and after treatment with short-course RT (scRT) (n=22) and lcRT (n=40). Patient LC were also recorded before and after RT. Moreover, flow cytometry was utilized in order to assess RT’s effect on the peripheral T-cell subpopulations (CD4+, CD8+, CD25+, FOXP3+ T-cells) in 20 patients (10 patients from each cohort). Immunohistochemical and in vitro study: Immunohistochemistry was conducted, aiming to study the expression of HLA-class-I, β2-microglobulin, TAP-1, PD-L1 and STING/IFNβ in preoperative biopsies and respective post-CRT (lcRT) surgical specimens from 27 rectal adenocarcinoma patients. The human colorectal adenocarcinoma cell lines HT-29 and Caco-2 were used in order to further investigate RT’s effects; Western blot analysis and Real time PCR (RT-PCR) were performed. Results: Retrospective clinical study: The LC of patients were significantly decreased post-treatment with CRT (median values: 2184/μl and 517/μl before and after treatment, respectively; p<0.0001). A statistically significant correlation was noted between poor tumor regression grade (TRG) and lower LC (p=0.03). No association between ypT-stage or ypN status and LC was confirmed. Furthermore, lymphopenia was significantly linked with poorer distant metastasis-free survival (p=0.003). No patient (0%) with LC above 518/μl developed distant metastases vs. 44.5% of patients with lower LC values. Prospective clinical-laboratory study: The IFNβ plasma levels of patients after scRT were significantly increased (p=0.004). Enhanced post-RT IFNβ levels were associated with improved pathological tumor regression (p=0.003). Substantial lymphopenia was recorded in all patients after treatment completion. However, patients treated with scRT displayed significantly higher post-RT LC compared to lcRT patients (p=0.001). Although no marked effect of RT on the percentages of CD4+ and CD8+ T-cells was demonstrated with either treatment schedule, the absolute LC of CD8+ T-cells post-RT were marginally higher in the scRT group (p=0.07). Finally, it was shown that patients treated with lcRT had significantly higher percentages of regulatory CD4+/CD25+ T-cells after treatment (p=0.02). Immunohistochemical and in vitro study: Rectal carcinomas exhibited extensive loss of HLA-class-I related molecules expression, which was restored in post-irradiation surgical specimens (p<0.0001). IFNβ and STING were significantly induced in both cancer cells and tumor-infiltrating lymphocytes after RT (p<0.0001). In cancer cell line experiments, upregulation of the HLA-class-I protein was confirmed after 4 or 10 Gy irradiation (p<0.001). PD-L1 levels were transiently induced for two days (p<0.001). Three fractions of 8 Gy or 1 fraction of 20 Gy led to a significant increase of the mRNA levels of cGAS, STING, IFNβ and the downstream genes (MX1, MX2, UBE2L6v2, IFI6v2 and IFI44) (p<0.001). No effects of RT on TREX1 mRNA levels were observed. Conclusions: Rectal adenocarcinoma patients experience substantial lymphopenia after neoadjuvant RT, with subsequent implications on tumor response and prognosis. scRT, however, appears to confer lesser lymphotoxicity, limited regulatory T-cell activation and potent IFN-type-I pathway stimulation compared to lcRT. Moreover, HLA-class-I molecules expression and IFNβ/STING proteins are significantly upregulated in cancer cells after RT. The transient induction of PD-L1 expression suggests that lcRT may sustain increased PD-L1 levels. Anti-PD-L1/PD-1 immunotherapy could block this immunosuppressive pathway. Overall, our findings confirm a significant interplay between RT and the immune system, that could be exploited in immuno-RT trials for patients with rectal adenocarcinomas. Hypofractionated RT (scRT) could prove to be key in enhancing immunotherapy efficacy.

Εισαγωγή: Η προεγχειρητική ακτινοθεραπεία (ΑΚΘ) κατέχει σημαντικό ρόλο στην αντιμετώπιση του τοπικά προχωρημένου αδενοκαρκινώματος ορθού. Οι πρόσφατες εξελίξεις στην ανοσοθεραπεία για το καρκίνωμα του ορθού υποδηλώνουν τη σημαντική συνεισφορά του ανοσοποιητικού συστήματος στον έλεγχο της συγκεκριμένης νόσου. Πειραματικές μελέτες έχουν αποδείξει πως η ΑΚΘ έχει τόσο ανοσο-κατασταλτικές, όσο και ανοσο-ενισχυτικές ιδιότητες. Ειδικά για το αδενοκαρκίνωμα του ορθού, ένας σημαντικός αριθμός επιστημονικών εργασιών έχουν καταδείξει την άμεση επίδραση της ΑΚΘ και της χημειο-ΑΚΘ (Χ-ΑΚΘ) στην έκφραση ανοσοτροποποιητικών μορίων από τα καρκινικά κύτταρα, και στην ποιότητα και συγκέντρωση των λεμφοκυττάρων και μονοκυττάρων που εντοπίζονται στο μικροπεριβάλλον των ακτινοβοληθέντων όγκων. Το ερευνητικό ενδιαφέρον έχει στραφεί στην ανεύρεση του βέλτιστου συνδυασμού ανοσοθεραπείας και ΑΚΘ. Υλικά και μέθοδοι: Αναδρομική κλινική μελέτη: Μελετήθηκαν 33 ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα ορθού που αντιμετωπίστηκαν με κλασσικά κλασματοποιημένη Χ-ΑΚΘ (ΚΚ-ΑΚΘ). Ο πρωτεύων στόχος ήταν η μελέτη των επιδράσεων της Χ-ΑΚΘ στον αριθμό των λεμφοκυττάρων (ΑΛ) του περιφερικού αίματος, καθώς και της σχετιζόμενης με την Χ-ΑΚΘ λεμφοπενίας στην ανταπόκριση του όγκου και την πρόγνωση των ασθενών. Προοπτική κλινικο-εργαστηριακή μελέτη: Πραγματοποιήθηκε η τεχνική ELISA για την ανάλυση των επιπέδων της IFNβ στο πλάσμα των ασθενών με τοπικά προχωρημένο αδενοκαρκίνωμα του ορθού, πριν και μετά από προεγχειρητική υποκλασματοποιημένη ΑΚΘ (ΥΚ-ΑΚΘ) (n=22) και ΚΚ-ΑΚΘ (n=40). Επίσης, καταγράφηκε ο ΑΛ των ασθενών πριν και μετά την ΑΚΘ, και διενεργήθηκε κυτταρομετρία ροής (Flow cytometry), προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση της ΑΚΘ στους υποπληθυσμούς των Τ-λεμφοκυττάρων (CD4+, CD8+, CD25+, FOXP3+ T-λεμφοκυττάρα) του περιφερικού αίματος 20 ασθενών (10 ασθενείς από κάθε ομάδα). Ανοσοϊστοχημική και in vitro μελέτη: Πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημεία, με στόχο τη μελέτη της έκφρασης των HLA-class-I, β2-μικροσφαιρίνης, TAP1, PD-L1 και STING/IFNβ στο βιοψιακό υλικό (προ θεραπείας) και το χειρουργικό παρασκεύασμα μετά την ΑΚΘ (ΚΚ-ΑΚΘ) 27 ασθενών με αδενοκαρκίνωμα του ορθού. Επιπρόσθετα, χρησιμοποιηθήκαν οι κυτταρικές σειρές καρκίνου παχέος εντέρου HT-29 και Caco-2 για την περαιτέρω μελέτη των επιδράσεων της ΑΚΘ, μέσω των τεχνικών ανοσοαποτύπωσης (Western Blot) και αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμέρασης σε πραγματικό χρόνο (Real time PCR, RT-PCR). Αποτελέσματα: Αναδρομική μελέτη: Ο ΑΛ των ασθενών μειώθηκε σημαντικά μετά τη KK-ΑΚΘ (διάμεσες τιμές 2184/μl και 517/μl πριν και μετά τη θεραπεία, αντίστοιχα; p<0.0001). Παρόλο που δεν ανευρέθη καμία συσχέτιση μεταξύ του ypT ή ypN σταδίου και του ΑΛ, ο χαμηλότερος ΑΛ συσχετίστηκε σημαντικά με μειωμένου βαθμού παθολογοανατομική υποστροφή του όγκου (tumor regression grade-TRG) (p=0.03). Επίσης, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση της λεμφοπενίας με μειωμένη ελεύθερης απομακρυσμένων μεταστάσεων επιβίωση (p=0.003). Κανένας ασθενής (0%) με ΑΛ μεγαλύτερο από 518/μl δεν παρουσίασε απομακρυσμένες μεταστάσεις, έναντι 44.5% των ασθενών με χαμηλότερες τιμές. Προοπτική κλινικο-εργαστηριακή μελέτη: Τα επίπεδα της IFNβ πλάσματος των ασθενών αυξήθηκαν σημαντικά μετά την ΥΚ-ΑΚΘ (p=0.004). Υψηλότερα επίπεδα IFNβ μετά την ΑΚΘ συσχετίστηκαν σημαντικά με υψηλότερου βαθμού παθολογοανατομική υποστροφή του όγκου (p=0.003). Αν και όλοι οι ασθενείς παρουσίασαν σοβαρή λεμφοπενία μετά τη θεραπεία, ο ΑΛ των ασθενών μετά το πέρας της YK-ΑΚΘ ήταν σημαντικά μεγαλύτερος συγκριτικά με αυτόν των ασθενών που έλαβαν ΚΚ-ΑΚΘ (p=0.001). Καμία επίδραση της ΑΚΘ δεν παρατηρήθηκε στο ποσοστό των CD4+ και CD8+ T-λεμφοκυττάρων, ανεξάρτητα από το σχήμα που χρησιμοποιήθηκε. Παρ’ όλ’ αυτά, ο απόλυτος αριθμός των CD8+ T-λεμφοκυττάρων μετά την ΑΚΘ ήταν οριακά μεγαλύτερος στους ασθενείς που έλαβαν ΥΚ-ΑΚΘ (p=0.07). Επιπρόσθετα, οι ασθενείς που αντιμετωπίστηκαν με KK-ΑΚΘ είχαν σημαντικά υψηλότερο ποσοστό ρυθμιστικών (ανοσοκατασταλτικών) CD4+/CD25+ Τ-λεμφοκυττάρων μετά τη θεραπεία (p=0.02). Ανοσοϊστοχημική και in vitro μελέτη: Τα αδενοκαρκινώματα του ορθού παρουσίασαν εκτεταμένη απώλεια της έκφρασης των σχετιζόμενων με το HLA-class-I μορίων, η οποία αποκαταστάθηκε στα χειρουργικά παρασκευάσματα μετά την ΑΚΘ (p<0.0001). Παρατηρήθηκε σημαντική επαγωγή της έκφρασης των μορίων IFNβ και STING από την ΑΚΘ στα καρκινικά κύτταρα και στα λεμφοκύτταρα που διηθούσαν τον όγκο (p<0.0001). Στα in vitro πειράματα, επιβεβαιώθηκε αύξηση της έκφρασης των μορίων HLA-class-I μετά από ακτινοβόληση με 4 ή 10 Gy (p<0.001). Επίσης, σημειώθηκε παροδική επαγωγή της έκφρασης του PD-L1 στις καρκινικές σειρές για 2 ημέρες μετά την ΑΚΘ (p<0.001). Τρία κλάσματα ΑΚΘ των 8 Gy ή 1 κλάσμα ΑΚΘ των 20 Gy οδήγησε σε σημαντική αύξηση των επιπέδων mRNA των cGAS, STING, IFNβ, καθώς και των καθοδικών αυτών γονιδίων MX1, MX2, UBE2L6v2, IFI6v2 και IFI44 (p<0.001). Τα επίπεδα mRNA του TREX1 παρέμειναν σταθερά. Συμπεράσματα: Οι ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του ορθού παρουσιάζουν σημαντική λεμφοπενία μετά την προεγχειρητική ΑΚΘ, με επιπτώσεις στην ανταπόκριση του όγκου και την πρόγνωση. Η ΥΚ-ΑΚΘ επιφέρει μικρότερη λεμφοτοξικότητα, περιορισμένη ενεργοποίηση των ρυθμιστικών Τ-λεμφοκυττάρων και πιο ισχυρή ενεργοποίηση της οδού της IFN-τύπου-Ι, συγκριτικά με την ΚΚ-ΑΚΘ. Επιπρόσθετα, η έκφραση των μορίων HLA-class-I και IFNβ/STING επάγεται σημαντικά στα καρκινικά κύτταρα μετά την ΑΚΘ. Η παροδική αύξηση της έκφρασης του PD-L1 στα καρκινικά κύτταρα μετά τη χορήγηση ενός κλάσματος ΑΚΘ υποδεικνύει πως η καθημερινή ΚΚ-ΑΚΘ μπορεί να διατηρεί την έκφρασή του στον όγκο σε υψηλά επίπεδα. Η ανοσοθεραπεία έναντι του PD-L1/PD-1 θα μπορούσε να αναστείλει αυτήν την ανοσοκατασταλτική οδό. Συνολικά, τα ευρήματά μας επιβεβαιώνουν τη σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ της ΑΚΘ και του ανοσοποιητικού συστήματος, που θα μπορούσε να αξιοποιηθεί σε κλινικές μελέτες ανοσο-ΑΚΘ για το αδενοκαρκίνωμα ορθού. Η ΥΚ-ΑΚΘ φαίνεται ότι να συμβάλλει σημαντικά στην προσπάθεια για την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας της ανοσοθεραπείας.