Μελέτη του ρόλου της ομάδας των Minibrain/DYRK κινασών στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος

Abstract

Cross-talk between Mirk/Dyrk1B kinase and Sonic hedgehog (Shh)/Gli signaling pathway affects physiology and pathology. The observations of the present doctoral thesis reveal a novel role for Dyrk1B in regulating ventral progenitor and neuron subtypes in the embryonic chick spinal cord (SC) via the Shh pathway. Initially, it was investigated the developmental pattern of Dyrk1B expression in mouse and chick CNS during embryogenesis, postnatal, and adult life. It was shown that Dyrk1B is expressed by proliferating neuroblasts and postmitotic neurons of the brain and spinal cord as well as its expression in the dentate gyrus of the mouse brain marks all stages of secondary and adult neurogenesis. Furthermore, Dyrk1B expression is decreased during mouse and chick CNS development, indicating an important role of Dyrk1B in the first stages of neurogenesis. In ovo gain-and-loss-of-function approaches at E2 showed that Dyrk1B affects the proliferation and differentiation of neuronal progenitors at E4 and impacts apoptosis specifically in the motor neuron (MN) domain. Especially, Dyrk1B overexpression decreases the numbers of ventral progenitors, MNs, and V2a interneurons, while the pharmacological inhibition of endogenous Dyrk1B kinase activity by AZ191 inhibitor administration increases the numbers of ventral progenitors and MNs. Mechanistically, Dyrk1B overexpression suppresses Shh, Gli2, and Gli3 mRNA levels, while conversely, Shh, Gli2, and Gli3 transcription is increased in the presence of Dyrk1B inhibitor AZ191 or Smoothened agonist SAG. Most importantly, in phenotype rescue experiments, SAG restores the Dyrk1B-mediated dysregulation of ventral progenitors. In addition, at E6, Dyrk1B selectively affects the medial lateral motor column (LMCm), consistent with the expression of Shh in this region. Collectively, these observations reveal a novel regulatory function of Dyrk1B kinase in suppressing the Shh/Gli pathway and thus affecting ventral progenitors in the developing spinal cord. These results make Dyrk1B kinase a possible therapeutic target for motor neuron diseases.

Η διασταυρούμενη επίδραση μεταξύ της κινάσης Mirk/Dyrk1B και του σηματοδοτικού μονοπατιού Sonic hedgehog (Shh)/Gli επηρεάζει τη φυσιολογία και την παθολογία. Τα ευρήματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποκαλύπτουν ένα νέο ρόλο για την κινάση Dyrk1B στη ρύθμιση των κοιλιακών προγονικών και νευρωνικών υποτύπων στον εμβρυϊκό νωτιαίο μυελό του κοτόπουλου διαμέσου του μονοπατιού Shh. Αρχικά, διερευνήθηκε το αναπτυξιακό πρότυπο έκφρασης της κινάσης Dyrk1B στο ΚΝΣ του ποντικού και του κοτόπουλου κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, μεταγεννητικής και ενήλικης ζωής. Δείχθηκε ότι η κινάση Dyrk1B εκφράζεται από τους πολλαπλασιαζόμενους νευροβλάστες και τους μεταμιτωτικούς νευρώνες του εγκεφάλου και του νωτιαίου μυελού και ότι η έκφρασή της στην οδοντωτή έλικα του εγκεφάλου του ποντικού σηματοδοτεί όλα τα στάδια της δευτερογενούς και ενήλικης νευρογένεσης. Επιπροσθέτως, η έκφραση της Dyrk1B μειώνεται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του ΚΝΣ του ποντικού και του κοτόπουλου υποδεικνύοντας ένα σημαντικό ρόλο της κινάσης Dyrk1B στα πρώτα στάδια της νευρογένεσης. Προσεγγίσεις in ovo ‘προσθήκης’ και ‘απώλειας λειτουργίας’ (gain-and-loss-of-function approaches) στο αναπτυξιακό στάδιο E2 έδειξαν ότι η κινάση Dyrk1B επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των νευρωνικών προγονικών κυττάρων στο στάδιο E4 και επιδρούν στην απόπτωση, ειδικά στην περιοχή των κινητικών νευρώνων (motor neuron domain). Ειδικότερα, η υπερέκφραση της κινάσης Dyrk1B ελαττώνει τους αριθμούς των κοιλιακών προγονικών κυττάρων, των κινητικών νευρώνων και των ενδιάμεσων νευρώνων V2a, ενώ η φαρμακολογική αναστολή της ενεργότητας κινάσης της ενδογενούς Dyrk1B από τη χορήγησης του ειδικού αναστολέα της, AZ191, αυξάνει τους αριθμούς των κοιλιακών προγονικών κυττάρων και των κινητικών νευρώνων. Μηχανιστικά, η υπερέκφραση της κινάσης Dyrk1B καταστέλλει τα επίπεδα mRNA του μορφογόνου Shh και των τελεστών Gli2 και Gli3, ενώ αντιθέτως, η μεταγραφή των Shh, Gli2 και Gli3 αυξάνεται παρουσία του αναστολέα της κινάσης Dyrk1B AZ191 ή του αγωνιστή της πρωτεΐνης Smoothened, SAG. Πιο σημαντικά, στα πειράματα ‘διάσωσης φαινοτύπου’ (phenotype rescue experiments), ο αγωνιστής SAG αποκαθιστά τη διαμεσολαβούμενη από την κινάση Dyrk1B απορρύθμιση των κοιλιακών προγονικών κυττάρων. Επίσης, στο στάδιο E6, η κινάση Dyrk1B επηρεάζει εκλεκτικά το μέγεθος της μεσαίας πλευρικής κινητικής στήλης (medial lateral motor column, LMCm), στην οποία και αποδείχθηκε η περιορισμένη έκφραση του μορφογόνου Shh στην ηλικία αυτή. Συμπερασματικά, αυτές οι παρατηρήσεις αποκαλύπτουν μία νέα ρυθμιστική λειτουργία της κινάσης Dyrk1B στην καταστολή του σηματοδοτικού μονοπατιού Shh/Gli επηρεάζοντας, συνεπώς, τα κοιλιακά προγονικά κύτταρα του αναπτυσσόμενου νωτιαίου μυελού. Αυτά τα δεδομένα καθιστούν την κινάση Dyrk1B έναν πιθανό θεραπευτικό στόχο για τις ασθένειες των κινητικών νευρώνων.