Ετερόλογη υπερέκφραση και ακινητοποίηση ενζύμων διάσπασης αρωματικών ενώσεων σε νανοϋλικά: νανοβιοτεχνολογικές εφαρμογές

Abstract

The steadily increasing industrial activity and excessive urbanization inevitably lead to the release of various pollutants, rendering environmental pollution one of the main problems of the modern era. Pollutants such as phenol and hydroxybenzoic acids tend to accumulate in the environment and threaten not only adjacent ecosystems, but also human health. Biodegradation is the most sustainable approach for removing such pollutants from the environment. Biodegradation relies on microorganisms, that have the ability to grow in the presence of pollutants and utilize them as sole carbon and energy sources. Microorganisms and their enzymes involved in biodegradation processes can be used as efficient biocatalysts in pollutant removal. To enhance the performance of a biocatalyst, immobilization methods are employed, which offer stability, reusability and better control of the reaction. Pseudarthrobacter phenanthrenivorans Sphe 3 isolated from a creosote polluted site in Epirus is a versatile biocatalyst and its’ genome harbors genes involved in the degradation of various aromatic compounds. The present thesis aimed to study Sphe3 catabolic enzymes (mono / dioxygenases), which are able to degrade aromatic compounds and also, develop new biocatalytic systems through enzyme immobilization onto nanomaterials followed by their characterization. In this context, phenol metabolism in Sphe3 was studied. The strain is capable of efficiently catabolizing up to 1500 mg / L of phenol as the sole source of carbon and energy, mainly via the catechol ortho-cleavage route, as indicated by intermediate metabolites’ identification and transcriptomic analysis. The immobilization of Sphe3 cells in alginate seems to protect the cells from the toxic compound, as a complete removal of 1000 mg phenol/L was observed at 192 h, their phenol removal activity was retained even after 30 days of storage and also, alginate-entrapped cells could be reused for five cycles retaining their phenol removal activity over 75%. Considering the reusability and stability of immobilized cells upon storage are crucial coefficients for their applicability in a bioremediation system, P. phenanthrenivorans Sphe3 is proved to meet these requirements making it a fine candidate for phenol removal. To develop the nanobiocatalytic systems the enzymes catechol 1,2-dioxygenase (1,2-CDO), 3-hydroxybenzoic acid 4-hydroxylase (3HB4H) and gentisate 1,2-dioxygenase (GDO) from Sphe3 were immobilized onto nickel-functionalized polydopamine-coated magnetic nanoparticles (Ni2+-PDA-MNPs), achieving at the same time the purification of each enzyme from crude extracts through the His-tag affinity of the recombinant enzyme to the Ni2+-functionalized surface of the carrier. Moreover, the use of MNPs as an immobilization carrier allows the recovery of the nanobiocatalyst simply by applying a magnetic field. The immobilization of 1,2-CDO led to the development of a nanobiocatalyst with optimal activity at 50 °C and enhanced durability at 30, 40 and 50 °C. In addition, it can be reused up to 7 times maintaining more than 50% of its original activity. These characteristics render the nanobiocatalyst suitable for applications both in bioremediation and in industry aiming at the removal of aromatic compounds and the production of cis, cis-muconic acid (ccMA), respectively. ccMA was identified as the product of 1,2-CDO when catechol was used as substrate by NMR spectroscopy. This interesting finding was further investigated by expressing the recombinant Sphe3 1,2-CDO in E. coli BL21(DE3) cells and used them for the production of ccMA. When transformed E. coli BL21(DE3) cells were supplement with catechol, ccMA was indeed produced, which proves that the enzyme can be exploited in a biocatalytic system for the production of high added value products.3HB4H immobilization led to a higher affinity for the substrate 3-hydroxybenzoic acid (3-HBA), while the nanobiocatalyst exhibited slightly increased thermostability when incubated at 30, 40 and 50 °C. The immobilization seems to have also favored the stability of the enzyme upon storage, since it showed 10-20% increased activity compared to the free form of the enzyme at 10, 20 and 30 days of storage at −20 °C. Also, the nanobiocatalyst was reused 3 times maintaining the activity of 3HB4H >40%, while activity was still detected after 5 cycles of reactions. It is of high importance to point out that this is the first time a 3HB4H nanobiocatalyst was developed and biochemically characterized. Moreover, this enzyme has not been biochemically characterized in many microorganisms and the information about 3HB4H from Sphe3 characterization, provided in this work, is clearly important. In addition, this is the first time that protocatechuic acid (PCA) was identified by NMR spectroscopy as the reaction’s product when 3-hydroxybenzoic acid (3-HBA) was used as a substrate. Another interesting and innovative achievement of the present work is the use of E. coli BL21(DE3) cells expressing the recombinant Sphe3 3HB4H to monitor in real-time the enzymatic conversion of 3-HBA to PCA by in - cell NMR spectroscopy, inside living cells. This methodology bypasses the time-consuming and costly procedures of purifying an enzyme in order to study the reactions it catalyzes. Also, it is possible to study the respective enzyme in its natural cellular environment, obtaining more accurate data regarding its real properties .Last but not least, immobilization of GDO, which is an extremely unstable enzyme unable to retain its activity for long time, resulted in retaining more than 60% of its activity after 30 days of storage at −20 ° C. It is important to mention that the successful immobilization of GDO has not been reported again in the literature until now.

Η σταθερά αυξανόμενη βιομηχανική δραστηριότητα αλλά και η υπέρμετρη αστικοποίηση, αναπόφευκτα οδηγούν στην παραγωγή μεγάλου όγκου αποβλήτων, καθιστώντας την περιβαλλοντική ρύπανση ως ένα από τα κύρια προβλήματα της σύγχρονης εποχής. Ρύποι όπως η φαινόλη και τα υδροξυβενζοϊκά οξέα, τείνουν να συσσωρεύονται στο περιβάλλον και απειλούν όχι μόνο τα παρακείμενα οικοσυστήματα, αλλά και την ανθρώπινη υγεία. Μια από τις πιο βιώσιμες προσεγγίσεις για την εξυγίανση των προαναφερθέντων οικοσυστημάτων είναι η απομάκρυνση αυτών των ρύπων με την αξιοποίηση του μεταβολικού μηχανισμού μιας πληθώρας μικροοργανισμών, που αναπτύσσονται στα οικοσυστήματα αυτά χρησιμοποιώντας τους εκάστοτε ρύπους ως πηγές άνθρακα και ενέργειας, μια διαδικασία που ονομάζεται βιοαποδόμηση. Τόσο οι μικροοργανισμοί που επιτελούν διαδικασίες βιοαποδόμησης όσο και τα ένζυμα που συμμετέχουν σε αυτές, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αποδοτικοί βιοκαταλύτες για την απομάκρυνση τέτοιων ρύπων. Μια από τις μεθόδους που επιστρατεύεται για την ενίσχυση της απόδοσης ενός βιοκαταλύτη είναι η ακινητοποίησή τους σε διάφορα μέσα - παραδοσιακά και πιο σύγχρονα - που προσφέρει σταθερότητα, δυνατότητα επαναχρησιμοποίησής του και καλύτερο έλεγχο της αντίδρασης. Το Pseudarthrobacter phenanthrenivorans Sphe3, που απομονώθηκε από μια βαριά ρυπασμένη περιοχή της Ηπείρου, είναι ένας μικροοργανισμός που δυνητικά αποτελεί έναν ευέλικτο βιοκαταλύτη καθώς διαθέτει στο γονιδίωμά του τη γενετική πληροφορία για την έκφραση καταβολικών ενζύμων που αναγνωρίζουν και διασπούν ποικιλία αρωματικών ενώσεων. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν, αρχικά, η μελέτη καταβολικών ενζύμων (μονο/διοξυγονασών) του Sphe3, τα οποία παίζουν καθοριστικό ρόλο στην αποδόμηση αρωματικών ενώσεων με απώτερο στόχο, την ανάπτυξη νέων βιοκαταλυτικών συστημάτων μέσω της ακινητοποίησης των ενζύμων σε νανοϋλικά. Στο πλαίσιο αυτό, μελετήθηκε η πορεία μεταβολισμού της φαινόλης στο Sphe3. Το στέλεχος έχει την ικανότητα να αναπτύσσεται παρουσία φαινόλης ως η μοναδική πηγή άνθρακα και ενέργειας και μπορεί να μεταβολίσει μέχρι και 1500 mg/L φαινόλης, μέσω της ortho-πορείας σχάσης της κατεχόλης, όπως αποδείχθηκε μέσω ταυτοποίησης ενδιάμεσων μεταβολιτών και μεταγραφομικής μελέτης. Τα κύτταρα Sphe3 ακινητοποιήθηκαν σε αλγινικό νάτριο και ήταν ικανά να καταβολίσουν πλήρως 1000 mg/L φαινόλης σε 192 ώρες, διατήρησαν την ικανότητα αποδόμησης της φαινόλης ακόμη και μετά από 30 ημέρες αποθήκευσης, ενώ κατέστη εφικτό να επαναχρησιμοποιηθούν για τουλάχιστον πέντε κύκλους διατηρώντας περισσότερο από το 75% της αρχικής ικανότητας καταβολισμού. Τα αποτελέσματα αυτά καθιστούν το στέλεχος Sphe3 καλό υποψήφιο για μελλοντικές εφαρμογές βιοαποδόμησης της φαινόλης. Για την ανάπτυξη βιοκαταλυτικών συστημάτων ακινητοποιήθηκαν τα ένζυμα 1,2-διοξυγονάση της κατεχόλης (1,2-CDO), 4-υδροξυλάση του 3-υδροξυβενζοϊκού οξέος (3ΗΒ4Η), και 1,2-διοξυγονάση του γεντισικού οξέος (GDO) του Sphe3 σε μαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίου σιδήρου (Fe2O4) επικαλυμμένα με πολυντοπαμίνη (PDA) και ενεργοποιημένα με ιόντα νικελίου (Ni2+). Τα ανασυνδυασμένα ένζυμα έφεραν ουρά πολύ-ιστιδίνης, κάτι που επέτρεψε και την απομόνωση του κάθε ενζύμου από το εκάστοτε κυτταρικό εκχύλισμα, ενώ η χρήση των μαγνητικών νανοσωματιδίων ως φορείς ακινητοποίησης επιτρέπει την εύκολη ανάκτηση του νανοβιοκαταλύτη. Η ακινητοποίηση της 1,2-CDO οδήγησε στην ανάπτυξη ενός νανοβιοκαταλύτη με βέλτιστη θερμοκρασία δράσης τους 50 °C και ενισχυμένη ανθεκτικότητα στις θερμοκρασίες 30, 40 και 50 °C. Επιπλέον, μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί μέχρι 7 φορές διατηρώντας τη δραστικότητά του άνω του 50%. Τα χαρακτηριστικά αυτά καθιστούν το νανοβιοκαταλύτη κατάλληλο για εφαρμογές τόσο στην απορρύπανση, όσο και στη βιομηχανία με στόχο την απομάκρυνση αρωματικών ενώσεων και την παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας όπως το cis, cis-μουκονικό οξύ (ccMA). Το ccMA ταυτοποιήθηκε ως προϊόν της δράσης της 1,2-CDO με την κατεχόλη ως υπόστρωμα μέσω φασματοσκοπίας NMR. Η συγκεκριμένη ενδιαφέρουσα παρατήρηση οδήγησε στη διερεύνηση της ικανότητας μετασχηματισμένων κυττάρων E. coli BL21(DE3) που εκφράζουν την ανασυνδυασμένη 1,2-CDO, να παράγουν ccMA όταν αναπτύσσονται παρουσία κατεχόλης. Η υπόθεση αυτή επιβεβαιώθηκε, αποδεικνύοντας ότι το ένζυμο μπορεί να αξιοποιηθεί σε ένα βιοκαταλυτικό σύστημα παραγωγής προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η ακινητοποίηση της 3ΗΒ4Η, οδήγησε στην αύξηση της συγγένειας του ενζύμου για το υπόστρωμα 3-HBA και επιπλέον, ο νανοβιοκαταλύτης εμφάνισε ελαφρώς αυξημένη θερμοσταθερότητα κατά την επώασή του στους 30, 40 και 50 °C, σε σύγκριση με το ελεύθερο ένζυμο. Η ακινητοποίηση φαίνεται να ευνόησε και τη σταθερότητα του ενζύμου κατά την αποθήκευση, αφού παρουσίασε 10-20% αυξημένη δραστικότητα, σε σχέση με την ελεύθερη μορφή του ενζύμου, στις 10, 20 και 30 ημέρες αποθήκευσης στους −20 °C. Τέλος, ο νανοβιοκαταλύτης επαναχρησιμοποιήθηκε 3 φορές διατηρώντας τη δραστικότητα της 3HB4H >40%, ενώ ανιχνεύθηκε δραστικότητα μέχρι και μετά από 5 κύκλους επαναχρησιμοποίησης. Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι είναι η πρώτη φορά που πραγματοποιήθηκε η ακινητοποίηση μιας 3ΗΒ4Η και ο βιοχημικός χαρακτηρισμός του αντίστοιχου νανοβιοκαταλύτη. Είναι ακόμη από τις λίγες φορές που το ελεύθερο ένζυμο χαρακτηρίστηκε βιοχημικά, ενώ για πρώτη φορά ταυτοποιείται το πρωτοκατεχοϊκό οξύ ως προϊόν της αντίδρασης με υπόστρωμα 3-ΗΒΑ, μέσω NMR. Οι πληροφορίες λοιπόν που προκύπτουν σε αυτή την εργασία για τις βέλτιστες συνθήκες δράσης του είναι σαφώς σημαντικές. Ένα ακόμη ενδιαφέρον και καινοτόμο επίτευγμα της παρούσας εργασίας είναι η χρήση κυττάρων E. coli BL21(DE3) που εκφράζουν την ανασυνδυασμένη 3ΗΒ4Η για την παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο της ενζυμικής μετατροπής του 3-ΗΒΑ σε PCA με την in-cell NMR φασματοσκοπία, μέσα στα ζωντανά κύτταρα. Μέσω της διαδικασίας αυτής παρακάμπτονται οι χρονοβόρες και κοστοβόρες διαδικασίες καθαρισμού ενός ενζύμου με σκοπό τη μελέτη των αντιδράσεων που αυτό καταλύει. Επίσης, δίνεται η δυνατότητα μελέτης του εκάστοτε ενζύμου στο φυσιολογικό κυτταρικό περιβάλλον αποκομίζοντας δεδομένα που ανταποκρίνονται περισσότερο στις πραγματικές του ιδιότητες. Τέλος, η ακινητοποίηση της GDO, ενός εξαιρετικά ασταθούς ενζύμου ως προς τη διατήρηση της δραστικότητάς του είχε ως αποτέλεσμα τη διατήρηση της δραστικότητάς της άνω του 60% μετά από 30 ημέρες αποθήκευσης του νανοβιοκαταλύτη στους −20 °C. Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι η επιτυχής ακινητοποίηση της GDO δεν έχει αναφερθεί ξανά στη βιβλιογραφία μέχρι τώρα.