Πειραματική διερεύνηση μηχανισμών δημιουργίας ανασυνδυασμών του γονιδιώματος με μοριακές τεχνικές

Abstract

Genomic instability is characterized by an increased frequency of simple or complex mutations, changes in the nucleotide sequence (substitutions, deletions, base insertions), DNA breaks, structural or numerical chromosomal abnormalities (aneuploidy, translocations, deletions, duplications, inversions, insertions, sister chromatid exchanges). Genomic instability refers to a variety of DNA alterations, ranging from single nucleotide mutation to chromosomal aneuploidy (loss or extra copy of a chromosome). Chromosomal instability is common characteristic in various types of cancer, with 90% of human cancer types harboring structural and numerical chromosomal abnormalities. Chromosomal instability occurs due to errors in the DNA repair process. DNA strand breaks repair occurs through various mechanisms of homologous or non-homologous recombination. Errors in the repair of DNA double-strand breaks through the mechanism of homologous recombination can lead to erroneous chromosomal rearrangements. Repetitive sequences are short or long patterns of DNA that occur in multiple copies throughout human chromosomes that create segments with high homology between homologous and non-homologous chromosomes. Thus, a break in a chromosomal region can lead to the fusion with a region of high homology of a non-homologous chromosome or chromatid. Sister chromatid exchange is a natural phenomenon that occurs frequently in dividing somatic and gametic cells and is a recombination mechanism that involves the reciprocal exchange of homologous segments of DNA between sister chromatids of a chromosome. Aim of the present dissertation was to investigate two crucial questions, whether:1.SARS-CoV-2 infection is associated with genomic instability2.Retrotransposition affects human genome integrity. The first part of that question was approached through the chromosomal SCE analysis of lymphocyte cells derived from whole blood samples of COVID-19 patients and healthy participants as control group. No statistically significant difference emerged regarding SCE events between COVID-19 patients and healthy individuals. Regarding the second part of this study’s aim, we analyzed SCE events in human U-373 and U-87 glioma cell lines, which produced high retrotransposition frequencies in both cell lines after retrotransposition induction through transfection with the nonautonomous, LTR-retrotransposon HERV-K10. We observed an increased frequency of SCE among the U-87 cell lines following the increment of retrotransposition events. Further analysis with aCGH revealed that in the genome of the clone cells with the low and medium frequency of retrotransposition events, a significant number of CNVs that had been identified in the DNA of the clone cells were absent. In contrast, in the genome of the clone cells with the high rate of retrotransposition, the number of CNVs was increased, but it involved chromosomal regions in which CNVs had already been identified in hemizygosity, in the genome of the other clone cells. The mechanism of replicative recombination of retrotransposable elements potentially increases recombination hotspots on chromosomes, allowing the repair of genomic lesions through homologous recombination. High rates of retrotransposition above a threshold may lead to a high number of DNA double-strand breaks (DSBs) accumulating in the genome, escaping the cell's repair mechanisms, making retrotransposition an aggravating factor for the genome integrity.

Η αστάθεια του γενώματος χαρακτηρίζεται από αυξημένη συχνότητα απλών ή σύνθετων μεταλλαγών, αλλαγές στη νουκλεοτιδική αλληλουχία (υποκαταστάσεις, ελλείψεις, ενθέσεις βάσεων), θραύσεις του DNA, δομικές ή αριθμητικές ανωμαλίες των χρωμοσωμάτων (ανευπλοειδίες, μεταθέσεις, ελλείψεις, διπλασιασμοί, αναστροφές, ενθέσεις, ανταλλαγές αδερφών χρωματίδων). Γίνεται αντιληπτό ότι η γενωμική αστάθεια αναφέρεται σε μία πληθώρα παραλλαγών του DNA, που περιλαμβάνει από την μεταλλαγή ενός νουκλεοτιδίου μέχρι την ανευπλοειδία (απώλεια ή επιπλέον αντίγραφο) ενός χρωμοσώματος. Η χρωμοσωματική αστάθεια είναι πολύ συχνή στους διάφορους τύπους καρκίνου, με το 90% των καρκίνων στον άνθρωπο να φέρουν δομικές και αριθμητικές χρωμοσωματικές ανωμαλίες. Η χρωμοσωματική αστάθεια προκύπτει λόγω σφαλμάτων κατά τη διαδικασία επιδιόρθωσης του DNA. Οι βλάβες των αλυσίδων του DNA επιδιορθώνονται μέσω διάφορων μηχανισμών ανασυνδυασμού, ομόλογου ή μη ομόλογου. Λάθη κατά την επιδιόρθωση των θραύσεων της διπλής έλικας του DNA μέσω του μηχανισμού του ομόλογου ανασυνδυασμού, μπορεί να οδηγήσουν σε εσφαλμένες χρωμοσωματικές ανακατατάξεις. Τα ανθρώπινα χρωμοσώματα φέρουν επαναλαμβανόμενο DNA το οποίο δημιουργεί τμήματα με υψηλή ομολογία μεταξύ ομολόγων και μη ομόλογων χρωμοσωμάτων. Οπότε, θραύση σε μία χρωμοσωματική περιοχή μπορεί να οδηγήσει στη συνένωση με μια περιοχή υψηλής ομολογίας ενός μη ομόλογου χρωμοσώματος η χρωματίδας. Η ανταλλαγή αδερφών χρωματίδων είναι ένα φυσικό φαινόμενο που συμβαίνει συχνά σε διαιρούμενα σωματικά και γαμετικά κύτταρα και αποτελεί έναν μηχανισμό ανασυνδυασμού που περιλαμβάνει την αμοιβαία ανταλλαγή ομόλογων τμημάτων DNA μεταξύ των αδελφών χρωματίδων ενός χρωμοσώματος. Σκοπός της διατριβής αυτής αποτέλεσε η διερεύνηση δύο κύριων ερωτημάτων, εάν: 1. Η νόσηση από τον SARS-CoV-2 συσχετίζεται με γενωμική αστάθεια. 2. Η ρετρομετάθεση έχει επιπτώσεις στην ακεραιότητα του γενώματος. Στην παρούσα εργασία, το πρώτο ερώτημα προσεγγίστηκε μέσω της χρωμοσωμικής ανάλυσης μεταφασικών κυττάρων από δείγματα περιφερικού ολικού αίματος ασθενών COVID-19, όπου μελετήσαμε τα γεγονότα ανταλλαγών αδελφών χρωματίδων ως δείκτη γενωμικής αστάθειας. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν, δεν φανέρωσαν στατιστικά σημαντική διαφορά στη συχνότητα SCE μεταξύ των ασθενών και υγιών ατόμων. Όσον αφορά το δεύτερο ερώτημα του σκοπού της παρούσης διατριβής, μελετήσαμε τα γεγονότα ανταλλαγών αδελφών χρωματίδων σε κύτταρα ανθρώπινων γλοιωματικών κυτταρικών σειρών (U-373- και U-87 MG) στα οποία είχε γίνει επαγωγή της ρετρομετάθεσης μέσω διαμόλυνσης των κυττάρων με το μη-αυτόνομο, LTR-ρετροτρανσποζόνιο, HERV-K10, η οποία οδήγησε στην παραγωγή ποικίλης συχνότητας ρετρομετάθεση σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Παρατηρήσαμε αυξημένη συχνότητα SCE μεταξύ των κυτταρικών σειρών U-87 που ακολουθούσε τη συχνότητα ρετρομετάθεσης. Η περαιτέρω ανάλυση με μικροσυστοιχίες DNA aCGH, αποκάλυψε ότι στο γένωμα των κυττάρων των κλώνων με την χαμηλή κα μεσαία συχνότητα γεγονότων ρετρομετάθεσης, απουσίαζε σημαντικός αριθμός CNVs τα οποία είχαν εντοπιστεί στο DNA των κυττάρων κλώνων. Αντίθετα, στο γένωμα των κυττάρων των κλώνων με το υψηλό ποσοστό ρετρομετάθεσης, ο αριθμός των CNVs ήταν αυξημένος, αφορούσε όμως χρωμοσωμικές περιοχές στις οποίες είχαν ήδη εντοπιστεί σε CNVs σε ημιζυγωτία, στο γένωμα των κυττάρων των υπόλοιπων κυτταρικών σειρών U-87 που αναλύθηκαν. Ο μηχανισμός του αντιγραφικού ανασυνδυασμού των ρετρομεταθετών στοιχείων ενδεχομένως να αυξάνει τα hotspot ανασυνδυασμού στα χρωμοσώματα, επιτρέποντας την επιδιόρθωση των γενωμικών βλαβών μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού. Όταν τα ποσοστά ρετρομετάθεσης είναι υψηλά, πιθανώς ο αριθμός των θραύσεων της διπλής έλικας των αλυσίδων DNA (DSBs) που συσσωρεύεται στο γένωμα, να είναι πέρα του ορίου αντοχής για τον μηχανισμό επιδιόρθωσης του κυττάρου, και πλέον η ρετρομετάθεση να αποτελεί επιβαρυντικό παράγοντα.