Ανάπτυξη πολυπαραγοντικών μοντέλων για μελέτη διαπερατότητας φαρμάκων σε σκευάσματα ενδοκολπικής χορήγησης

Abstract

The large number of drug candidates that are synthetized in the laboratories do not always achieve the desired behavior, therefore, modern pharmaceutical research is focused on the development of reliable in silico methods in order to study the behavior of pharmacologically active substances. In the context of this PhD thesis, an attempt was made to study in silico, in vitro and ex vivo the permeability mechanism of drugs intended for vaginal use. Thus, 3 different prediction models for the intravaginal administrated drugs were developed. The first consisted of structurally simple compounds, the second of steroid drugs and the third of an extensive group of 108 compounds (drugs and non-drugs). The aim was to correlate the in vitro permeability from artificial cellulose membranes (apparent permeability coefficient, Papp), with their physicochemical and structural properties. The permeability of the compounds was determined experimentally in Franz diffusion cells and the results (variable Y) were correlated with their physicochemical properties and structural characteristics (variable X) using the Partial Least Squares (PLS) method. The PLS models were validated and based on the results of the VIP plots (Variables Importance Projection) for the importance of the variables, the most important properties that affect the permeability were highlighted. Simple and rapid HPLC-PDA or ESI-MS methods were developed and validated for the quantification of the samples of the in vitro experiments. The pharmacokinetic, physicochemical and structural characteristics of the compounds were calculated either by appropriate software programs or obtained from free online databases. In the third model, the support vector machine (SVM) method was also used to develop a prediction model. Both methods were validated and based on the statistical parameters, the SVM model shows higher predictability while the PLS adequately interprets the permeability theory. In the last stage of the present study, the suitability of five artificial membranes for their use in in vitro permeability experiments was evaluated. The study was performed on six intravaginally administered drugs (econazole, miconazole, clindamycin, lidocaine, nonoxynol-9 and metronidazole) and the in vitro results were studied and compared with corresponding ex vivo experiments conducted on cow vaginal tissue. In conclusion, the permeation of vaginal drugs from a tissue involves three distinct functions, transport, targeting, and penetration. Solubility properties ensure its transport, lipophilicity its approach and molecular size its penetration. Finally, the developed PLS model was applied to predict the Papp of the 6 compounds under study and showed that it can reliably predict the range of Papp values.

Ο μεγάλος αριθμός των υποψηφίων φαρμάκων που συντίθενται δεν επιτυγχάνει πάντα την επιθυμητή συμπεριφορά με αποτέλεσμα, ως εκ τούτου, η σύγχρονη φαρμακευτική έρευνα επικεντρώνεται στην ανάπτυξη αξιόπιστων in silico μεθόδων για τη μελέτη της συμπεριφοράς των φαρμακευτικώς δραστικών ουσιών. Στα πλαίσια εκπόνησης της παρούσας διδακτορικής διατριβής, έγινε μια προσπάθεια να μελετηθεί in-silico, in-vitro και ex-vivo ο μηχανισμός διαπερατότητας φαρμάκων που προορίζονται για κολπική χρήση. Έτσι, αναπτύχθηκαν 3 διαφορετικά μοντέλα πρόβλεψης της ενδοκολπικής διαπερατότητας. Το πρώτο αποτελούνταν από απλές δομικά ενώσεις, το δεύτερο από στεροειδή φάρμακα και το τρίτο από μία εκτενή ομάδα 108 ενώσεων (φάρμακα και μη φάρμακα). Στόχος ήταν η ο συσχετισμός της in vitro διαπερατότητας τους από τεχνητές μεμβράνες κυτταρίνης (συντελεστής φαινόμενης διαπερατότητας, Papp), με τις φυσικοχημικές και δομικές ιδιότητές τους. Η διαπερατότητα των ενώσεων προσδιορίστηκε πειραματικά σε κελιά διάχυσης Franz και τα αποτελέσματα (μεταβλητή Υ) συσχετίστηκαν με τις φυσικοχημικές ιδιότητες και δομικά χαρακτηριστικά τους (μεταβλητή Χ) με τη βοήθεια της μεθόδου των Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων (Partial Least Squares, PLS ). Τα PLS μοντέλα επικυρώθηκαν και βάσει των αποτελεσμάτων του VIP ραβδογράμματος (Variables Importance Projection) σημαντικότητας των μεταβλητών αναδείχτηκαν οι σημαντικότερες ιδιότητες που επηρεάζουν την διαπερατότητα. Για την ποσοτικοποίηση των δειγμάτων των in vitro πειράματων αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν απλές και γρήγορες HPLC-PDA ή ESI-MS μέθοδοι. Τα φαρμακοκινητικά, φυσικοχημικά και δομικά χαρακτηριστικά των ενώσεων υπολογίστηκαν είτε από κατάλληλα λογισμικά προγράμματα (software) ή ελήφθησαν από ελεύθερες βάσεις δεδομένων. Στο τρίτο μοντέλο έγινε χρήση και της μεθόδου μηχανικής υποστήριξης διανυσμάτων (support vector machine-SVM) για την ανάπτυξη μοντέλου πρόβλεψης. Και οι δύο μέθοδοι επικυρώθηκαν και βάσει των στατιστικών παραμέτρων, το SVM μοντέλο παρουσιάζει υψηλότερη προβλεψιμότητα ενώ το PLS ερμηνεύει επαρκώς τη θεωρία της διαπερατότητας. Στο τελευταίο στάδιο της παρούσας μελέτης έγινε αξιολόγηση της καταλληλόλητας πέντε τεχνητών μεμβρανών για την χρήση τους σε in vitro πειράματα διαπερατότητας. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε έξι ενδοκολπικώς χορηγούμενα φάρμακα (εκοναζόλη, μικοναζόλη, κλινδαμυκίνη, λιδοκαΐνη, νονοξυνόλη-9 και μετρονιδαζόλη) και τα in vitro αποτελέσματα μελετήθηκαν και συγκρίθηκαν με αντίστοιχα ex vivo πειράματα που διεξήχθησαν σε κολπικό ιστό αγελάδας. Συμπερασματικά, η διαπέραση των κολπικών φαρμάκων από έναν ιστό περιλαμβάνει τρεις διακριτές λειτουργίες τη μεταφορά, την προσέγγιση στο στόχο και τη διείσδυση. Οι ιδιότητες διαλυτότητας εξασφαλίζουν τη μεταφορά του, η λιποφιλικότητα την προσέγγισή του και το μοριακό μέγεθος τη διείσδυσή του. Τέλος, εφαρμόστηκε το PLS μοντέλο που αναπτύχθηκε στην πρόβλεψη των Papp των υπό μελέτη 6 ενώσεων και έδειξε ότι μπορεί να προβλεφθεί αξιόπιστα την σειρά των τιμών Papp.