Μελέτη της ομοιοστασίας των Β λεμφοκυττάρων στη συστηματική σκλήρυνση

Abstract

Introduction: Systemic sclerosis (SSc) is a systemic autoimmune disease characterized by microvasculopathy, autoantibodies (autoAbs), and excessive collagen deposition. The pathogenesis of this disease is incompletely understood and the clinical manifestations vary. B cells play an important role in its pathogenesis. Our clinic reported a reduction of regulatory B cells in SSc, that results in reduced inhibitory effects on B effector cells. CD21low B cells are increased in many autoimmune diseases and were reported to include autoreactive cells. Aim: The aim of our study was to study the significance of CD21low B lymphocytes in SSc. Therefore, we studied CD21low B cells and their relation to the main aspects of the disease. We also studied CD32 receptors of B cells (B lymphocytes express almost exclusively, one of the three isoforms of the CD32 receptor, the inhibitor FcγRIIB isoform), and B cells that recognize Topoisomerase I (Topo I). Patients: Our study included twenty-seven patients (21 women, median age 55,6 years, 7 men, median age 59,5 years), followed up in the Outpatient Clinic of the Department of Rheumatology and clinical Immunology of the University General Hospital of Larissa, and 15 age-and sex-matched healthy controls (HCs). Patients were fulfilling the ACR / EULAR 2013 criteria for SSc. All participants gave their informed consent. The study was carried out after the approval of the ethics committee. Methods: Mononuclear cells were isolated from20 mL of peripheral blood after centrifugation in Ficoll and B cell surface markers were detected using multicolor flow cytometry with the monoclonal antibodies anti-CD19, anti-CD27, anti-CD32 (which recognizes both isoforms FcγRIIA and FcγRIIB) and anti-CD21. In addition, recombinant Topo I was APC-conjugated to detect B cells recognizing Topo I. Results: Fourteen patients had a history or active digital ulcer, 10 patients had interstitial lung disease and 17 patients had anti-Topo I antibodies. The percentage of CD21low B cells was significantly increased in patients with DUs (51.33%) compared to HCs (28.15%, p=0.014) and to patients without DUs (29.34%, p=0.042) and in patients with Interstitial Lund Disease (ILD) (53.1%) compared to HCs (28.1% p=0.014). There was no statistically significant difference of CD21low B cells between the ILD group and the non-ILD (33.47%, p=0.08). The percentage of CD21low B cells in the anti-Topo I-positive patient group (48.6%), was significantly increased compared to anti-Topo I-negative patient group (27.3%, p=0.025), but not significantly so compared to HCs (28.1%, p= 1.1). CD21low B cells were not significantly increased in SSc patients compared to HCs (40.7% vs 28.15%, p=0.10).The percentage of CD21lowCD32low B cells was significantly increased in patients with DUs (23.82%) compared to HCs (4.43%, p=0.009) and to patients without DUs (4.39%, p = 0.015). CD21lowCD32low B cells were also significantly increased in the ILD group (28.43%) compared to HCs (4.43%, p=0.001) and to non-ILD group (6.25%, p=0.007) and in the anti-Topo I-positive patients (21.54%) compared to HCs (4.43%, p=0.012) and to anti-Topo I-negative patients (2.45%, p=0.022). No difference was found in the percentage of CD21lowCD32low B cells between men and women patients (14.61% vs 14.43%, p=0.98). Also, the percentage of CD21lowCD32low B cells did not show a statistically significant increase in all patients with SSc compared to HCs (14.47%, 4.43% p=0.08).CD32low B cells predominantly recognized Topo I compared to CD32+ B cells (mean difference 35.18, 95%CI 26.89 to 43.47, p=0.0003). Also, the expression of B cell receptors for Topo I was higher on CD32low B cells compared to CD32+ B cells. Conclusion: The increased percentage of CD21lowCD32low B cells in patients with main pathogenetic aspects of SSc (microangiopathy, ILD, and anti-Topo I autoantibodies) further supports the autoreactive nature of CD21lowCD32low B cells in SSc.

Εισαγωγή: Η Συστηματική Σκλήρυνση (ΣΣκ) είναι μια συστηματική νόσος του συνδετικού ιστού, που χαρακτηρίζεται από μικροαγγειοπάθεια, παραγωγή αυτοαντισωμάτων και εκτεταμένη εναπόθεση κολλαγόνου. Η παθογένεια της νόσου δεν είναι πλήρως γνωστή και οι κλινικές της εκδηλώσεις ποικίλλουν. Σημαντικό ρόλο στην παθογένειά της διαδραματίζουν τα Β λεμφοκύτταρα. Η κλινική μας βρήκε ελάττωση των ρυθμιστικών Β λεμφοκυττάρων στη ΣΣκ, που άφηνε με μειωμένη ανασταλτική επίδραση τα εκτελεστικά (effective) Β κύτταρα. Τα CD21low Β κύτταρα είναι αυξημένα σε διάφορες αυτοάνοσες παθήσεις και περιέχουν αυτοαντιδραστικά κύτταρα. Σκοπός: Σκοπός της μελέτης μας ήταν να μελετήσουμε τη σημασία των CD21low Β κύτταρων στη ΣΣκ. Για το σκοπό αυτό μελετήσαμε τα CD21low κύτταρα και την συσχέτισή τους με όλες τις σημαντικές εκφάνσεις της νόσου. Έπειτα μελετήσαμε τον CD32 υποδοχέα των Β κύτταρων (τα Β κύτταρα εκφράζουν σχεδόν αποκλειστικά μόνο μία από τις τρεις ισομορφές του CD32 υποδοχέα, την FcγRIIB ισομορφή, που έχει ανασταλτική δράση, και την συσχέτιση του με τις κλινικές εκδηλώσεις της νόσου. Τέλος, διερευνήσαμε κατά πόσο αυτά τα Β λεμφοκύτταρα είναι αυτοαντιδραστικά έναντι της Τοποϊσομεράσης Ι.Ασθενείς: Στη μελέτη συμμετείχαν είκοσι-επτά ασθενείς (21 γυναίκες, με μέση ηλικία 55,6 έτη, 7 άνδρες, με μέση ηλικία 59,5 έτη), που παρακολουθούνταν στο Εξωτερικό Ιατρείο της Ρευματολογικής κλινικής και Κλινικής Ανοσολογίας του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Λάρισας, καθώς και 15 υγιή άτομα (healthy controls, ΗCs). Οι ασθενείς πληρούσαν τα κριτήρια της ACR/EULAR του 2013 για την ΣΣκ. Από κάθε ασθενή ελήφθησαν 20 mL περιφερικού αίματος μετά από ενημερωμένη συγκατάθεση. Η μελέτη έγινε μετά από έγκριση της Τοπικής Επιτροπής Δεοντολογίας. Μέθοδοι: Έγινε απομόνωση μονοπύρηνων κυττάρων από το περιφερικό αίμα ύστερα από φυγοκέντρηση σε Ficoll και ανάλυση επιφανειακών δεικτών Β κυττάρων με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής ύστερα από χρώση με τα μονοκλωνικά αντισώματα anti-CD19, anti-CD27, anti-CD32 (που αναγνωρίζει και τις δύο ισομορφές FcγRIIΑ και FcγRIIB) και anti-CD21. Τέλος, αξιολογήθηκαν τα Β κύτταρα που αναγνωρίζουν την Τοποϊσομεράση Ι (αντι-Τοπο I). Αποτελέσματα: Από τους 27 ασθενής οι 14 είχαν ιστορικό ή και ενεργό δακτυλικό έλκος, 10 ασθενείς είχαν διάμεση πνευμονική ίνωση, και 17 ασθενείς είχαν αντι-Τοπο I αντισώματα. Το ποσοστό CD21low Β κυττάρων (51,33%) ήταν αυξημένο στην ομάδα ασθενών με δακτυλικά έλκη (ΔΕ) σε σχέση με τους HCs (28,15%, p=0,014) και σε σχέση με τους ασθενείς που δεν είχαν ΔΕ ( 29,34%, p = 0,042). Το ποσοστό των CD21low B κυττάρων στην ομάδα ασθενών με Διάμεση Πνευμονική Ίνωση ήταν 53,1% στατιστικώς σημαντικά υψηλότερο σε σύγκριση με τους υγιείς (28,1% p=0,014), ενώ το αντίστοιχο ποσοστό στην ομάδα των ασθενών χωρίς Διάμεση Πνευμονική Ίνωση ήταν 33,47% - μη στατιστικά σημαντική διαφορά (p= 0,08). Το ποσοστό των CD21low B κυττάρων στην ομάδα των ασθενών με θετικά αντι-Τοπο Ι αντισώματα ήταν 48,6% και παρουσίαζε στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με την ομάδα των ασθενών χωρίς αντι-Τοπο Ι αντισώματα (27,3%, p=0,025), όχι όμως με την ομάδα των υγιών (28,1%, p= 1,1). Τα CD21low κύτταρα δεν ήταν αυξημένο στους ασθενείς με ΣΣκ συνολικά σε σχέση με τους υγιείς (HCs) (40,7% vs 28,15% p=0,10).Tο ποσοστό των CD21lowCD32low B κυττάρων ήταν σημαντικά αυξημένο σε ασθενείς με δακτυλικά έλκη (23,82%) σε σύγκριση με τους ΗCs (4,43%, p=0,009) και τους ασθενείς χωρίς εκδήλωση δακτυλικών ελκών (4,39%, p=0,015). Ακόμη, τα CD21lowCD32low Β κύτταρα βρέθηκαν αυξημένα στους ασθενείς με διάμεση πνευμονοπάθεια (28,43%), σε σύγκριση με τους HCs (4,43%, p=0,001) καθώς και σε σύγκριση με τους ασθενείς χωρίς διάμεση πνευμονοπάθεια (6,25%, p=0,007). Το ποσοστό των CD21lowCD32low Β κυττάρων ήταν επίσης αυξημένο (21.54%) στους αντι-Τοπο I θετικούς ασθενείς σε σχέση με τους HCs (4,43%, p=0,012) και σε σχέση με τους αντι-Τοπο I-αρνητικούς ασθενείς (2,45%, p=0,022). Στην παρούσα κλινική μελέτη δεν βρέθηκε διαφορά στο ποσοστό των CD21lowCD32low B κυττάρων μεταξύ αντρών και γυναικών ασθενών (14,61% vs 14,43%, p=0,98). Επίσης, το ποσοστό των CD21lowCD32low B κύτταρων δεν παρουσίαζαν στατιστικά σημαντική αύξηση στο σύνολο των ασθενών με ΣΣκ σε σύγκριση με τους υγιείς (14,47%, 4,43% p=0,08).Τέλος, τα CD32low B κύτταρα κυρίως αναγνώριζαν την Τοποϊσομεράση Ι σε σύγκριση με τα CD32+ B κύτταρα (μέση διαφορά 35,18, 95% CI 26.89 έως 43,47, p=0,0003), ενώ η έκφραση των υποδοχέων της Τοπο Ι ήταν αυξημένη στα CD32low B κύτταρα σε σχέση με τα CD32+ B κύτταρα.Συμπέρασμα: Η αύξηση των CD21lowCD32low Β κυττάρων σε ασθενείς με κύριες παθογενετικές εκδηλώσεις της νόσου (μικροαγγειοπάθεια, ίνωση, αντι-Τοπο Ι αυτοαντισώματα) περαιτέρω υποστηρίζει τον αυτοαντιδραστικό χαρακτήρα των CD21lowCD32low Β κυττάρων στην ΣΣκ.