Σχεδιασμός και ανάπτυξη καινοτόμων λειτουργικών τροφίμων με ακινητοποιημένες καλλιέργειες ευεργετικών μικροοργανισμών

Abstract

European Union (EU) is witnessing an increased interest in developing novel protein-enriched foods containing probiotic microorganisms and/or prebiotic dietary fibers with potential health-promoting effects. To maximize the benefits of probiotics, it is important i) to achieve increased stability of cultures, ii) to develop approaches compatible with the use of dried cultures for easy adoption by the industrial sector, and iii) to use microbial strains suitable for new products with specific characteristics. Recent studies indicate that the gut microbiota is involved in the development of Type 1 Diabetes Mellitus (T1DΜ), an autoimmune disease caused by the destruction of pancreatic insulin-producing β-cells mediated by T-lymphocytes. The gut microbiota of patients in the preclinical stage is characterized by reduced and unstable bacterial diversity and appears to contribute to the progression from β-cell autoimmunity to the clinical onset of the disease. In line with this objective, the primary goal of the current PhD thesis was to develop innovative immobilized functional starter cultures possessing potential health-promoting attributes, with a specific emphasis on T1DM, suitable for incorporation into novel food products. Initially, 20 wild-type bacterial strains (lactic acid bacteria -LAB) were isolated from traditional fermented Greek foods (traditional cheeses, olive fruits, and olive brine) and identified at species level using both biochemical and molecular methods. In brief, 14 strains were classified as Lacticaseibacillus rhamnosus, 4 as Lactiplantibacillus pentosus, 1 as Lacticaseibacillus paracasei, and 1 as Leuconostoc mesenteroides. To investigate the functional properties of the new wild-type strains, a series of in vitro assays were applied, including (a) inhibition activity against α-glucosidase, (b) determination of the growth inhibition activity against foodborne pathogens and spoilage microorganisms, (c) investigation of bile salt hydrolysis, (d) survival in simulated gastro-intestinal conditions, and (e) determination of the resistance of the isolated cultures to common antibiotics. According to the results, all strains showed inhibition activity against α-glucosidase in the range of 14.31 - 44.87%, with the highest inhibition percentage observed in the strain L. rhamnosus OLXAL-1. Strong growth inhibition activity of the non-neutralized cell-free supernatants (CFSs) of the wild-type strains was observed against common spoilage and pathogenic microorganisms. Additionally, bile salt hydrolysis ability was detected for L. pentosus OLTH-1, L. pentosus OLTH-2, L. pentosus OLTH-3, L. pentosus OLTH-4, and L. paracasei ALTH-2. The survival levels of the wild-type cultures under conditions simulating passage through the gastrointestinal tract ranged 0 - 58.98%, and in most cases, they were higher than the corresponding survival levels of the reference strain used (L. rhamnosus GG), a strain known for its probiotic properties. Noticeably, the strain L. rhamnosus OLXAL-1 was sensitive to all antibiotics tested, according to EFSA recommendations, and based on the overall in vitro test results, it was selected for further experimentation. Subsequently, agro-industrial residues (molasses and whey) and food wastes (expired milk and pineapple juice) were evaluated as potential growth nutrients compared to synthetic food-grade media for L. rhamnosus OLXAL-1 cell biomass production. Among the agro-industrial residues and food wastes tested, the highest cell concentration was observed when pineapple juice + milk mixture (1:1) was used (9.54 log CFU/mL), while high cell levels (> 9 log CFU/mL) were also determined in the cases of whey + pineapple juice (1:1) (9.34 log CFU/mL) and pineapple juice (9.05 log CFU/mL). For the next steps, however, a synthetic food-grade medium was developed, based on food-grade components, resulting in the highest levels of L. rhamnosus OLXAL-1 cell concentration (9.68 log CFU/mL) compared to all other nutrient media under study, including the reference medium MRS Broth. Subsequently, cell immobilization of L. rhamnosus OLXAL-1 cells on various natural supports [oat, wheat, peanut, Corinthian raisins, red and green apple, banana, and leek] and agro-industrial residues [whey protein, and milk (casein), brewer's spent grain (BSG) and grape peels] was studied. To optimize the immobilization conditions, the effect of immobilization time, the immobilization support size, and the microbial culture / immobilization support ratio were studied, aiming at achieving the maximum levels of immobilized cells. Since the production of dried cultures is a requirement for industrial applications, the effect of drying processes (freeze- and thermal-drying) on cell survival was also investigated. The results showed that significantly higher levels of cell concentrations were observed in the freeze-dried compared to the thermally-dried cultures, both in free cells and in the majority of the immobilized cultures. Additionally, the effect of storage at room (18-20 °C) and refrigerator temperature (4 °C) on the survival of immobilized cultures was studied for a period of up to 360 days. During storage at room temperature, higher cell survival rates were recorded in the majority of dried (freeze- or thermally-dried) immobilized cultures compared to the corresponding dried free cultures, while during storage for 360 days at both room and refrigerator conditions, no growth of spoilage or pathogenic microorganisms was observed in the dried immobilized cultures. The survival of free and immobilized L. rhamnosus OLXAL-1cells on natural supports was studied in a static in vitro digestion model. The results indicated that both wet and freeze-dried immobilized cultures exhibited superior survival rates compared to free cells, with the highest rate recorded in the immobilized cultures on oat flakes (> 81.22%). Based on the highest cell survival rates, oat flakes were selected as the optimal immobilization support and further tested in an in vivo BALB/c mouse model. Daily administration of free or immobilized L. rhamnosus cells on oat flakes, over a 10-day period, led to a significant increase in lactobacilli levels in the feces, intestinal tissue, and intestinal fluid of BALB/c male mice. Immobilization of L. rhamnosus cells on oat flakes positively affected cell survival during passage through the GI tract, resulting in significantly increased cell levels compared to feces from mice receiving free L. rhamnosus cells. Finally, the presence of L. rhamnosus at levels > 6 log CFU/g in the mice feces was confirmed by species-specific Multiplex PCR. Consequently, the potential regulation of the gut microbiome and intestinal microbiota was studied in healthy and streptozotocin-induced T1DM animal models («RCCHan:Wistar» rats), following the administration of the presumptive probiotic culture L. rhamnosus OLXAL-1. The dietary intervention protocol lasted 4 weeks and included 8 groups of animal models that received either a standard diet or a standard diet supplemented with oat flakes (control groups), or freeze-dried free or immobilized L. rhamnosus OLXAL-1 cultures on oat flakes (experimental groups). Blood, fecal, intestinal tissue, and intestinal content samples were collected to study the effect of the dietary intervention on the composition of the intestinal microbiota, gut microbiome, and the general health of diabetic animal models. According to the results of the microbiological analysis, significantly increased levels of Escherichia coli, enterobacteria, coliforms, enterococci, staphylococci, and clostridia in the fecal samples of the diabetic animals were observed. Cell counts of E. coli, enterobacteria, coliforms, and staphylococci in diabetic groups receiving the standard diet + oat flakes or the standard diet + immobilized culture L. rhamnosus OLXAL-1 on oat flakes at the end of the 4th week were significantly lower compared to the corresponding populations of diabetic groups receiving a standard diet and a standard diet + freeze-dried free culture L. rhamnosus OLXAL-1, suggesting that oat supplementation may delay the progression of intestinal dysbiosis by regulating intestinal microbiota. Likewise, increased levels of bifidobacteria in all animal groups receiving L. rhamnosus OLXAL-1 culture were recorded, particularly in the case of diabetic rats following a standard diet + immobilized culture L. rhamnosus OLXAL-1 on oat flakes. According to the Next Generation Sequencing (NGS) analysis, in the feces of all studied animal groups, Firmicutes and Bacteroidetes were identified as the prevailing phyla with relative abundancies ranging 60.00% - 90.00%, and 4.10% - 39.21%, respectively. At the genus level, significant variations in the relative abundances of Lactobacillus and Bifidobacterium were observed. Specifically, increased relative abundances of the genus Lactobacillus were observed in fecal samples of healthy groups receiving a standard diet + free or immobilized L. rhamnosus OLXAL-1 cells on oat flakes compared to healthy groups receiving a standard diet or a standard diet + oat flakes at the end of the experimental protocol. Similarly, increased relative abundances of the same genus were recorded in diabetic groups receiving a standard diet + free or immobilized f L. rhamnosus OLXAL-1 cells on oat flakes compared to the diabetic groups receiving a standard diet or a standard diet + oat flakes, though this increase was not significant. Moreover, increased relative abundances of the genus Bifidobacterium were detected in the fecal samples, collected at week 4 from the diabetic group administered free L. rhamnosus OLXAL-1 cells, in comparison to their initial levels (week 0), as well as to the other animal groups at the same timepoint (week 4). Finally, the determination of Short Chain Fatty Acids (SCFAs) and lactic acid levels in fecal samples from healthy and diabetic animals, led to several noteworthy findings: (a) a significant rise in lactic acid concentrations in fecal samples from both healthy and diabetic groups receiving either free or immobilized L. rhamnosus OLXAL-1 cells on oat flakes was noted, (b) elevated levels of acetic acid in fecal samples from diabetic animal models at the start of the experimental protocol (week 0) were observed, (c) an increase in acetic acid levels following the administration of free or immobilized L. rhamnosus OLXAL-1 cells on oat flakes in diabetic animal models at week 4 was recorded, and (d) elevated levels of butyric acid in fecal samples collected at week 4 of the dietary intervention from the healthy group that received immobilized L. rhamnosus OLXAL-1 cells on oat flakes were documented. The final part of the thesis involved the development of 3 novel food products (breakfast cereals, grape juice, and fermented sausages), fortified with immobilized cultures of the presumptive probiotic strain L. rhamnosus OLXAL-1. Initial levels of immobilized L. rhamnosus OLXAL-1 cells in breakfast cereals were > 8 log CFU/g (8.49 log CFU/g). During the sensory evaluation, a significantly higher score for aroma, taste, and overall estimation was documented for breakfast cereals with immobilized L. rhamnosus OLXAL-1 cells compared to a similar commercially available product. Initial levels of L. rhamnosus OLXAL-1 cells (free or immobilized) in grape juice were ~7.5 log CFU/g in all cases, and the sensory evaluation revealed a preference of the tasters for grape juice products with immobilized L. rhamnosus OLXAL-1 cells in apple pieces, mainly due to their novelty. In fermented sausages, after a 15-day fermentation period, weight loss > 30% of the initial weight and pH reduction < 5.30 were noted, indicating safe consumption and product stability. Throughout the fermentation process, LAB levels were significantly increased, reaching > 8.5 log CFU/g. The addition of whey protein resulted in higher overall scores during the sensory evaluation, while the addition of L. rhamnosus OLXAL-1 did not affect the overall evaluation of the final products. Additionally, cell survival of L. rhamnosus OLXAL-1 strain in the novel food products was evaluated during storage, the products’ shelf life was determined, and potential growth inhibition of spoilage microbes or foodborne pathogens was investigated after deliberate spiking. In breakfast cereals containing freeze-dried immobilized L. rhamnosus OLXAL-1 culture, cell levels remained > 7 log CFU/g both during storage at room temperature for 90 days and at refrigerated storage for 360 days, while no microbial spoilage was observed. Concerning the grape juice products fortified with free L. rhamnosus OLXAL-1 culture, cell levels remained around ~7 log CFU/g for the initial 2 days, followed by a notable reduction during storage at room temperature. However, during the same storage period, significantly higher cell concentrations (> 7 log CFU/g) were recorded in grape juice fortified with immobilized cells on apple pieces. However, storage at room temperature resulted in mold growth, leading to the rejection of products after 4 days in samples containing free cells. Conversely, when stored at refrigerator temperature (4 °C), cell levels in grape juice products enriched with both free or immobilized L. rhamnosus OLXAL-1 cells remained consistently stable, exceeding > 7 log CFU/g for up to 2 weeks. During room temperature storage, deliberate spiking experiments with S. cerevisiae and A. niger indicated significantly lower microbial levels in grape juice products containing immobilized L. rhamnosus OLXAL-1 cells on apple pieces compared to the products containing free L. rhamnosus OLXAL-1 cells and the control samples. In fermented sausages, LAB levels consistently ranged > 8.5 log CFU/g for up to 90 days in all products during refrigerated storage, except for the control group exclusively prepared with the addition of commercial starter culture (BessaSTART), in which cell levels declined significantly from 30 days of storage onwards, resulting in a final LAB concentration of 7.67 log CFU/g after 90 days. After the deliberate spiking with Salmonella spp., cell levels of the pathogen decreased significantly after 2 days in all products compared to the initial levels (> 4 log CFU/g), ranging 3.24 - 3.74 log CFU/g. Further reductions in Salmonella spp. levels were noted in subsequent sampling timepoints during the fermentation period (days 5, 10, & 15) and cell counts were significantly lower in products prepared with the addition of commercial starter culture BessaSTART along with free L. rhamnosus OLXAL-1 cells and in sausages containing the commercial starter culture BessaSTART + free L. rhamnosus OLXAL-1 cells + whey protein powder. Of note, Salmonella spp. was not detected by the end of the fermentation process (day 15). Conversely, in the BessaSTART and the BessaSTART + whey protein powder products (L. rhamnosus OLXAL-1 culture was not added), as well as in the product with BessaSTART + immobilized L. rhamnosus OLXAL-1 cells on whey protein, Salmonella spp. cell levels were determined > 2.72 log CFU/g at the end of the fermentation process. According to the NGS analysis, Firmicutes was the predominant phylum in all products, comprising over 95.48%, whereas lower relative abundances of the Proteobacteria phylum were determined, accounting for less than 4.52%. At the genus level, 13 distinct bacterial genera were identified, with Lactobacillus (49.53% – 80.47%), Leuconostoc (11.84% - 16.53%), and Staphylococcus (1.27% - 32.65%) prevailing. The presence of the Salmonella spp. genus was confirmed in all product groups, after deliberate spiking in relative abundances of less than 4%.In summary, the main results of this PhD thesis were (a) isolation and molecular characterization of the unique wild-type strain Lacticaseibacillus rhamnosus OLXAL-1 with functional properties in T1DM management, (b) utilization of agro-industrial residues and food wastes for the production of functional cultures biomass, (c) development of "ready-to-use" dried immobilized functional cultures on natural supports for use as functional food ingredients with a potential beneficial effect in modulating intestinal dysbiosis in T1DM and (d) novel dietary products with functional cultures, extended shelf life, and increased microbial safety.

Στην Ευρωπαϊκή Ένωση (ΕΕ) παρατηρείται σήμερα αυξημένο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη νέων τροφίμων που περιέχουν προβιοτικούς μικροοργανισμούς ή/και πρεβιοτικές διαιτητικές ίνες με πιθανές επιδράσεις στην προαγωγή της υγείας. Προκειμένου να μεγιστοποιηθούν τα οφέλη των προβιοτικών, είναι σημαντικό i) να επιτευχθεί αυξημένη βιωσιμότητα των καλλιεργειών, ii) να αναπτυχθούν προσεγγίσεις συμβατές με τη χρήση αποξηραμένων καλλιεργειών, έτσι ώστε να υιοθετηθούν εύκολα από τον βιομηχανικό τομέα, και iii) να χρησιμοποιηθούν μικροβιακά στελέχη κατάλληλα για νέα προϊόντα με ειδικά χαρακτηριστικά. Ταυτόχρονα, πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η εντερική μικροβιακή χλωρίδα εμπλέκεται στην ανάπτυξη του Σακχαρώδη Διαβήτη τύπου 1 (ΣΔτ1), μιας αυτοάνοσης νόσου που προκαλείται από την καταστροφή των παγκρεατικών ινσουλινοπαραγωγών β-κυττάρων μετά από μεσολάβηση των Τ-λεμφοκυττάρων. Η εντερική μικροβιακή χλωρίδα των ασθενών που βρίσκονται σε προ-κλινικό στάδιο χαρακτηρίζεται από μειωμένη και ασταθή βακτηριακή και λειτουργική ποικιλομορφία, και φαίνεται ότι συμβάλει στην εξέλιξη από την β-κυτταρική αυτοανοσία στην κλινική εμφάνιση της νόσου. Συνεπώς, σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η παραγωγή ακινητοποιημένων ευεργετικών αρχικών μικροβιακών καλλιεργειών με πιθανές ευεργετικές ιδιότητες στην υγεία, ιδίως όσον αφορά το ΣΔτ1, και η χρήση τους ως συστατικά για νέα λειτουργικά τρόφιμα.Aρχικά, πραγματοποιήθηκε απομόνωση και ταυτοποίηση 20 βακτηριακών στελεχών από ελληνικά παραδοσιακά προϊόντα, τα οποία εξετάστηκαν μέσω κατάλληλων in vitro δοκιμών για τις εν δυνάμει λειτουργικές τους ιδιότητες. Από τα 20 αγρίου τύπου στελέχη, 14 ταυτοποιήθηκαν ως Lacticaseibacillus rhamnosus, 4 ως Lactiplantibacillus pentosus, 1 ως Lacticaseibacillus paracasei και 1 ως Leuconostoc mesenteroides. Με στόχο τη διερεύνηση των λειτουργικών ιδιοτήτων των νέων αγρίου τύπου στελεχών, εφαρμόστηκε σειρά in vitro πειραματικών δοκιμών συμπεριλαμβανομένων: (α) μελέτη ικανότητας αναστολής της δράσης του ενζύμου α-γλυκοσιδάσης, (β) προσδιορισμός ανασταλτικής δράσης ανάπτυξης υπερκειμένων των αγρίου τύπου στελεχών έναντι τροφιμογενών παθογόνων και αλλοιογόνων μικροοργανισμών, (γ) μελέτη έκκρισης υδρολάσης χολικών αλάτων, (δ) επιβίωσης των εν δυνάμει προβιοτικών κυττάρων σε συνθήκες προσομοίωσης πέψης, και (ε) προσδιορισμός της ανθεκτικότητας των απομονωμένων καλλιεργειών έναντι κοινών αντιβιοτικών. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, όλα τα αγρίου τύπου στελέχη εμφάνισαν ικανότητα αναστολής του ενζύμου α-γλυκοσιδάση σε εύρος 14.31 - 44.87%, με το υψηλότερο ποσοστό αναστολής να παρατηρείται στο στέλεχος L. rhamnosus OLXAL-1. Επίσης, παρατηρήθηκε ισχυρή ανασταλτική δράση των μη-ουδετεροποιημένων υπερκειμένων διαλυμάτων των αγρίου τύπου στελεχών έναντι κοινών αλλοιογόνων και παθογόνων μικροοργανισμών και ικανότητα έκκρισης υδρολάσης χολικών αλάτων για τα στελέχη L. pentosus OLTH-1, L. pentosus OLTH-2, L. pentosus OLTH-3, L. pentosus OLTH-4, και L. paracasei ALTH-2. Τα επίπεδα επιβίωσης των αγρίου τύπου στελεχών σε συνθήκες που προσομοιάζουν τη διέλευση διαμέσου του γαστρεντερικού σωλήνα κυμάνθηκαν σε εύρος 0 - 58.98% και στις περισσότερες περιπτώσεις ήταν υψηλότερα από τα αντίστοιχα επίπεδα επιβίωσης των κυττάρων καλλιέργειας Lacticaseibacillus rhamnosus GG, στέλεχος αναφοράς με γνωστές προβιοτικές ιδιότητες. Όσον αφορά τον προσδιορισμό ανθεκτικότητας των αγρίου τύπου καλλιεργειών έναντι κοινών αντιβιοτικών, στο στέλεχος L. rhamnosus OLXAL-1 δεν παρατηρήθηκε ανθεκτικότητα σε κανένα από τα αντιβιοτικά που εξετάστηκαν, σύμφωνα με τις συστάσεις της EFSA, και με βάση το σύνολο των in vitro δοκιμών επιλέχθηκε για τη συνέχεια των πειραμάτων της παρούσας μελέτης.Στη συνέχεια, αγρο-βιομηχανικά απόβλητα (μελάσα και τυρόγαλα) και υπολείμματα τροφίμων (γάλα και χυμός ανανά μετά το πέρας της ημερομηνίας λήξεως) αξιολογήθηκαν ως πιθανά υποστρώματα ανάπτυξης καλλιέργειας L. rhamnosus OLXAL-1 συγκριτικά με συνθετικά μέσα καθαρότητας τροφίμου (food grade). Ανάμεσα στα αγρο-βιομηχανικά απόβλητα και υπολείμματα τροφίμων, τα υψηλότερα μέγιστα επίπεδα κυτταρικής συγκέντρωσης παρατηρήθηκαν στο μίγμα χυμού ανανά + γάλακτος (1:1) (9.54 log CFU/mL), ενώ ιδιαίτερα υψηλά επίπεδα κυτταρικής συγκέντρωσης (> 9 log CFU/mL) προσδιορίστηκαν και στις περιπτώσεις του τυρογάλακτος + χυμού ανανά (1:1) (9.34 log CFU/mL) και χυμού ανανά (9.05 log CFU/mL. Για τη συνέχεια των πειραμάτων, ωστόσο, επιλέχθηκε συνθετικό μέσο καθαρότητας τροφίμου, το οποίο αναπτύχθηκε στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής, επιλογή η οποία βασίστηκε στην περιεκτικότητα σε συστατικά καθαρότητας τροφίμου, αλλά και στο γεγονός ότι στο συγκεκριμένο θρεπτικό μέσο καταγράφηκαν τα υψηλότερα επίπεδα κυτταρικής συγκέντρωσης του στελέχους L. rhamnosus OLXAL-1 (9.68 log CFU/mL), συγκριτικά με το σύνολο των υπό μελέτη θρεπτικών μέσων, συμπεριλαμβανομένου και του θρεπτικού μέσου αναφοράς MRS Broth.Έπειτα, μελετήθηκε η ακινητοποίηση κυττάρων L. rhamnosus OLXAL-1 σε διάφορους φυσικούς φορείς και αγρο-βιομηχανικά απόβλητα [βρώμη, σιτάρι, αραχίδα, σταφίδα κορινθιακή, πρωτεΐνη τυρογάλακτος, και γάλακτος (καζεΐνη), brewer’s spent grain (BSG), κόκκινο και πράσινο μήλο, μπανάνα, και πράσο]. Με στόχο τη βελτιστοποίηση των συνθηκών ακινητοποίησης, προσδιορίστηκε ο βέλτιστος χρόνος παραμονής του φορέα ακινητοποίησης στη μικροβιακή καλλιέργεια, η επίδραση μεγέθους φορέα ακινητοποίησης, και η βέλτιστη αναλογία μικροβιακής καλλιέργειας/ φορέα ακινητοποίησης. Με δεδομένο ότι είναι απαραίτητη η παραγωγή ξηρών καλλιεργειών για τις βιομηχανικές εφαρμογές, μελετήθηκε, επίσης, η επίδραση διεργασιών ξήρανσης (λυοφιλίωση και θερμική ξήρανση) στην επιβίωση των κυττάρων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τόσο στα ελεύθερα κύτταρα, αλλά και στην πλειοψηφία των ακινητοποιημένων καλλιεργειών παρατηρήθηκαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα κυτταρικών συγκεντρώσεων στις λυοφιλιωμένες συγκριτικά με τις θερμικά αποξηραμένες καλλιέργειες. Επίσης, μελετήθηκε η επίδραση της αποθήκευσης σε θερμοκρασία δωματίου (18-20 °C) και ψυγείου (4 °C) στην επιβίωση των λειτουργικών καλλιεργειών, για διάστημα έως 360 ημέρες. Κατά την αποθήκευση σε θερμοκρασία δωματίου (18-20 °C), στην πλειοψηφία των ξηρών (θερμικά αποξηραμένων ή λυοφιλιωμένων) ακινητοποιημένων καλλιεργειών καταγράφηκαν ποσοστά κυτταρικής επιβίωσης υψηλότερα από τις αντίστοιχες ξηρές ελεύθερες καλλιέργειες, ενώ κατά την αποθήκευση για 360 ημέρες σε συνθήκες δωματίου και ψυγείου, δεν παρατηρήθηκε ανάπτυξη αλλοιογόνων ή παθογόνων μικροοργανισμών στις ξηρές ακινητοποιημένες καλλιέργειες.Επιπλέον, μελετήθηκε η επιβίωση των ακινητοποιημένων κυττάρων L. rhamnosus OLXAL-1 σε φυσικούς φορείς διαμέσου του γαστρεντερικού σωλήνα in vitro. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, οι υγρές και λυοφιλιωμένες ακινητοποιημένες καλλιέργειες που μελετήθηκαν παρουσίασαν υψηλότερα ποσοστά επιβίωσης σε σχέση με τα ελεύθερα κύτταρα, ενώ στα ακινητοποιημένα κύτταρα σε βρώμη παρατηρήθηκε το μεγαλύτερο ποσοστό επιβίωσης (> 81.22%). Στη συνέχεια, εφαρμόστηκε in vivo πειραματικό πρωτόκολλο αρσενικών μυών φυλής BALB/c, προκειμένου να μελετηθεί η προστατευτική δράση της ακινητοποίησης των κυττάρων L. rhamnosus σε νιφάδες βρώμης στην επιβίωση των χορηγούμενων καλλιεργειών μετά από διέλευση διαμέσου του γαστρεντερικού σωλήνα. Η ημερήσια χορήγηση (διάρκειας 10 ημερών) των λυοφιλιωμένων ελεύθερων ή ακινητοποιημένων L. rhamnosus κυττάρων σε νιφάδες βρώμης οδήγησε σε σημαντική αύξηση των επιπέδων των λακτοβακίλλων στα κόπρανα, στα δείγματα εντερικού περιεχομένου, και στα τμήματα εντερικού ιστού αρσενικών ποντικών BALB/c. Επίσης, η ακινητοποίηση των κυττάρων L. rhamnosus σε νιφάδες βρώμης φαίνεται να επηρέασε θετικά την ικανότητα επιβίωσης των κυττάρων κατά τη διέλευση διαμέσου του γαστρεντερικού σωλήνα, καθώς στις ομάδες ποντικών που έλαβαν ακινητοποιημένα κύτταρα παρατηρήθηκαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα λακτοβακίλλων σε σχέση με τις ομάδες ποντικών που έλαβαν ελεύθερα κύτταρα L. rhamnosus. Επιπλέον, η παρουσία κυττάρων L. rhamnosus σε επίπεδα > 6 log CFU/g επιβεβαιώθηκε στα κόπρανα των ποντικών μέσω Multiplex PCR. Σε επόμενο στάδιο, μελετήθηκε in vivo η πιθανή ρύθμιση της εντερικής μικροβιακής χλωρίδας σε υγιή και διαβητικά (επαγόμενος μετά από χορήγηση στρεπτοζοτοκίνης ΣΔτ1) ζωικά πρότυπα (επίμυες του είδους «RCCHan:Wistar»), μετά από χορήγηση καλλιέργειας L. rhamnosus OLXAL-1. Η καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1 χορηγήθηκε με τη μορφή λυοφιλιωμένων ελεύθερων ή ακινητοποιημένων κυττάρων σε νιφάδες βρώμης, ενώ παράλληλα στο πειραματικό πρωτόκολλο διατροφικής παρέμβασης, διάρκειας 4 εβδομάδων, συμπεριλήφθηκαν και ομάδες ζωικών προτύπων που έλαβαν αποκλειστικά τυπική δίαιτα ή τυπική δίαιτα με την προσθήκη νιφάδων βρώμης (ομάδες ελέγχου). Σύμφωνα με το πειραματικό πρωτόκολλο, συλλέχθηκαν δείγματα αίματος, κοπράνων, εντερικού ιστού, και εντερικού περιεχομένου, προκειμένου να μελετηθεί εκτενώς η επίδραση της διατροφικής παρέμβασης στη σύσταση της εντερικής μικροβιακής χλωρίδας, και του εντερικού μικροβιώματος, αλλά και στη γενική υγεία των διαβητικών ζωικών προτύπων. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η μικροβιολογική ανάλυση στα δείγματα κοπράνων έδειξε σημαντικά αυξημένα επίπεδα των βακτηριακών πληθυσμών Escherichia coli, εντεροβακτηριοειδών, κολοβακτηριδίων, εντεροκόκκων, σταφυλόκοκκων, και κλωστριδίων των διαβητικών ζωικών προτύπων. Παράλληλα, τα επίπεδα των πληθυσμών E. coli, εντεροβακτηριοειδών, κολοβακτηριδίων, και σταφυλόκοκκων των διαβητικών ομάδων που έλαβαν συμβατική δίαιτα + νιφάδες βρώμης και συμβατική δίαιτα + ακινητοποιημένη καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1 σε νιφάδες βρώμης κατά τη δειγματοληψία της 4ης εβδομάδας, αν και υψηλότερα από τα αντίστοιχα αρχικά επίπεδα (εβδομάδα 0), ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε σύγκριση με τους αντίστοιχους πληθυσμούς των διαβητικών ομάδων που έλαβαν συμβατική δίαιτα και συμβατική δίαιτα + λυοφιλιωμένη ελεύθερη καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1. Αυτό το εύρημα υποδηλώνει ότι η προσθήκη βρώμης ενδέχεται να καθυστερεί την εξέλιξη της εντερικής δυσβίωσης, ρυθμίζοντας την εντερική μικροβιακή χλωρίδα. Επιπλέον, εξίσου σημαντικό αποτέλεσμα αποτέλεσε η αύξηση των πληθυσμών των βακτηρίων γαλακτικού οξέος (LAB) στα δείγματα κοπράνων που συλλέχθηκαν στο τέλος της διατροφικής παρέμβασης στις υγιείς ομάδες που έλαβαν συμβατική δίαιτα + ελεύθερη ή ακινητοποιημένη καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1 σε νιφάδες βρώμης και στις διαβητικές ομάδες που έλαβαν συμβατική δίαιτα + ελεύθερη ή ακινητοποιημένη καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1 σε νιφάδες βρώμης, σε σύγκριση με τα αντίστοιχα αρχικά επίπεδα, αλλά και με τις ομάδες που δεν έλαβαν την καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1 (ζωικά πρότυπα που έλαβαν συμβατική δίαιτα ή συμβατική δίαιτα + νιφάδες βρώμης). Αναφορικά με τα αποτελέσματα των μικροβιακών πληθυσμών σε δείγματα εντερικού περιεχομένου και εντερικού ιστού, σε γενικές γραμμές, οι μεταβολές που προσδιορίστηκαν ήταν σε συμφωνία με τα αποτελέσματα των δειγμάτων κοπράνων. Ωστόσο, σημαντικό εύρημα αποτέλεσε η αύξηση των επιπέδων του γένους Bifidobacterium σε όλες τις ομάδες ζώων που έλαβαν καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1 και ιδιαίτερα στην περίπτωση της ομάδας διαβητικών επίμυων που ακολούθησαν συμβατική δίαιτα + ακινητοποιημένη καλλιέργεια Lacticaseibacillus rhamnosus OLXAL-1 σε νιφάδες βρώμης. Κατά τη μελέτη του εντερικού μικροβιώματος των ζωικών προτύπων με Αλληλούχιση Νέας Γενιάς (Next Generation Sequencing – NGS), τα φύλα Firmicutes και Bacteroidetes αναγνωρίστηκαν ως κυρίαρχα, με τα ποσοστά των σχετικών αφθονιών να κυμαίνονται σε τιμές 60.00% - 90.00 %, και 4.10 % - 39.21 % αντίστοιχα, ενώ σε επίπεδο γένους, σημαντικές μεταβολές παρατηρήθηκαν στα ποσοστά σχετικών αφθονιών των γενών Lactobacillus και Bifidobacterium. Αναλυτικότερα, στα δείγματα κοπράνων των υγιών ομάδων που έλαβαν συμβατική δίαιτα + ελεύθερη ή ακινητοποιημένη καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1 σε νιφάδες βρώμης παρατηρήθηκαν αυξημένα ποσοστά σχετικών αφθονιών του γένους Lactobacillus, σε σύγκριση με τις υγιείς ομάδες που έλαβαν συμβατική δίαιτα ή συμβατική δίαιτα + νιφάδες βρώμης μετά το τέλος του πειραματικού πρωτοκόλλου. Αντίστοιχα, αυξημένα ποσοστά του ίδιου γένους καταγράφηκαν στις διαβητικές ομάδες που έλαβαν συμβατική δίαιτα + ελεύθερη ή ακινητοποιημένη καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1 σε νιφάδες βρώμης, σε σύγκριση με τις διαβητικές ομάδες που έλαβαν συμβατική δίαιτα ή συμβατική δίαιτα + νιφάδες βρώμης, χωρίς όμως αυτή η αύξηση να είναι σημαντική. Επιπλέον, αυξημένα ποσοστά του γένους Bifidobacterium ανιχνεύτηκαν στα δείγματα κοπράνων της διαβητικής ομάδας που έλαβε ελεύθερη καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1, τα οποία συλλέχτηκαν στο τέλος του πειραματικού πρωτοκόλλου (εβδομάδα 4), σε σύγκριση με τα αντίστοιχα αρχικά ποσοστά (εβδομάδα 0), αλλά και με τις υπόλοιπες ομάδες ζωικών προτύπων στο ίδιο χρονικό σημείο (εβδομάδα 4). Κατά τον προσδιορισμό των λιπαρών οξέων μικρής αλύσου (SCFAs) και του γαλακτικού οξέος σε δείγματα κοπράνων των ζωικών προτύπων παρατηρήθηκαν: (α) σημαντική αύξηση των συγκεντρώσεων γαλακτικού οξέος στα δείγματα κοπράνων των υγιών και διαβητικών ομάδων που έλαβαν ελεύθερη ή ακινητοποιημένη καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1, σε σχέση με τα ζώα, στα οποία δεν χορηγήθηκε καλλιέργεια, (β) αυξημένα επίπεδα οξικού οξέος στα δείγματα κοπράνων των διαβητικών ζωικών προτύπων κατά την έναρξη του πρωτοκόλλου (εβδομάδα 0), (γ) αύξηση των επιπέδων οξικού οξέος μετά από χορήγηση ελεύθερης ή ακινητοποιημένης καλλιέργειας L. rhamnosus OLXAL-1 στα διαβητικά ζωικά πρότυπα (εβδομάδα 4), και (δ) αυξημένα επίπεδα βουτυρικού οξέος στα δείγματα κοπράνων της υγιούς ομάδας που έλαβε ακινητοποιημένη καλλιέργεια L. rhamnosus OLXAL-1 σε νιφάδες βρώμης που συλλέχθηκαν την 4η εβδομάδα της διατροφικής παρέμβασης.Το τελευταίο μέρος της διατριβής αφορούσε την παρασκευή 3 νέων πρότυπων προϊόντων (δημητριακά πρωινού, χυμός σταφύλι και αλλαντικά αέρος) εμπλουτισμένα με ακινητοποιημένα κύτταρα καλλιέργειας L. rhamnosus OLXAL-1 σε συστατικά τροφίμων. Στα νέα προϊόντα, προσδιορίστηκαν τα αρχικά κυτταρικά επίπεδα των καλλιεργειών, αλλά και μια σειρά από φυσικοχημικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Τα αρχικά επίπεδα των ακινητοποιημένων κυττάρων L. rhamnosus OLXAL-1 στα δημητριακά πρωϊνού ήταν > 8 log CFU/g (8.49 log CFU/g), ενώ κατά την αξιολόγηση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών, το προϊόν δημητριακών πρωϊνού με λυοφιλιωμένες ακινητοποιημένες καλλιέργειες L. rhamnosus OLXAL-1 παρουσίασε σημαντικά υψηλότερη βαθμολογία ως προς το άρωμα, τη γεύση, και τη συνολική εκτίμηση, σε σύγκριση με αντίστοιχο εμπορικά διαθέσιμο προϊόν. Τα αρχικά επίπεδα των κυττάρων L. rhamnosus OLXAL-1 στον χυμό σταφύλι ήταν ~7.5 log CFU/g σε όλες τις περιπτώσεις (προϊόντα με λυοφιλιωμένα ελεύθερα και ή ακινητοποιημένα κύτταρα), ενώ κατά τον οργανοληπτικό έλεγχο, τα προϊόντα με λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα L. rhamnosus OLXAL-1 σε κομμάτια μήλου ξεχώρισαν στην προτίμηση των δοκιμαστών, εξαιτίας της πρωτοτυπίας τους. Στα νέα προϊόντα αλλαντικών αέρος, κατά την περίοδο ωρίμανσης 15 ημερών, επιτεύχθηκε απώλεια βάρους > 30% του αρχικού βάρους και μείωση των τιμών pH < 5.30, τιμές συνιστώμενες για την ασφαλή κατανάλωση και τη σταθερότητα των ζυμωμένων προϊόντων κρέατος. Κατά την πρόοδο της ωρίμανσης, τα επίπεδα των LAB αυξήθηκαν σημαντικά, ακόμα και από την 5η ημέρα της ωρίμανσης και παρέμειναν σταθερά > 8.5 log CFU/g έως και το τέλος της. Η προσθήκη πρωτεΐνης τυρογάλακτος οδήγησε σε υψηλότερη συνολική βαθμολογία των προϊόντων κατά τον οργανοληπτικό έλεγχο, ενώ η προσθήκη καλλιέργειας L. rhamnosus OLXAL-1 δεν επηρέασε σημαντικά τη συνολική εκτίμηση των τελικών προϊόντων.Επιπρόσθετα, αξιολογήθηκε η επιβίωση των κυττάρων L. rhamnosus OLXAL-1 στα πρότυπα προϊόντα (δημητριακά πρωινού, χυμός σταφύλι και ζυμωμένα προϊόντα κρέατος), προσδιορίστηκε ο χρόνος ζωής, και διερευνήθηκε η πιθανή αναστολή ανάπτυξης τροφιμογενών αλλοιογόνων και παθογόνων μικροοργανισμών μετά από εσκεμμένη επιμόλυνση. Αναλυτικότερα, στα προϊόντα δημητριακών πρωϊνού με λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα L. rhamnosus OLXAL-1, κατά την αποθήκευση σε θερμοκρασία δωματίου για 90 ημέρες όσο και σε θερμοκρασία ψυγείου για 360 ημέρες, τα κυτταρικά επίπεδα παρέμειναν > 7 log CFU/g, ενώ σημαντικό στοιχείο αποτέλεσε το γεγονός ότι σε καμία περίπτωση δεν παρατηρήθηκε ανάπτυξη αλλοιογόνων μικροοργανισμών. Όσον αφορά τα προϊόντα χυμού, κατά την αποθήκευση σε θερμοκρασία δωματίου (18-20 °C), τα επίπεδα των ελεύθερων κυττάρων L. rhamnosus OLXAL-1 παρέμειναν ~7 log CFU/g προϊόντος έως τις πρώτες 2 ημέρες αποθήκευσης, ενώ ήδη μετά από 4 ημέρες, παρατηρήθηκε σημαντική μείωση. Για το ίδιο διάστημα αποθήκευσης, τα επίπεδα των ακινητοποιημένων κυττάρων L. rhamnosus OLXAL-1 σε κομμάτια μήλου παρέμειναν σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα (> 7 log CFU/g), αλλά εξαιτίας της εμφάνισης μούχλας την 4η ημέρα (επίπεδα ζυμών/μυκήτων > 3 log CFU/g), τα προϊόντα απορρίφθηκαν. Αντίθετα, κατά την αποθήκευση σε θερμοκρασία ψυγείου (4 οC), τα κυτταρικά επίπεδα στα προϊόντα χυμών που εμπλουτίστηκαν τόσο με ελεύθερα όσο και με ακινητοποιημένα κύτταρα L. rhamnosus OLXAL-1 παρέμειναν σταθερά > 7 log CFU/g για διάστημα έως 2 εβδομάδες. Στο πείραμα εσκεμμένης επιμόλυνσης των προϊόντων χυμού με S. cerevisiae και A. niger (104 log CFU/mL και 104 spores/mL, αντίστοιχα), τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κατά την αποθήκευση σε θερμοκρασία δωματίου, τα κυτταρικά επίπεδα των παραπάνω μικροοργανισμών ήταν σημαντικά χαμηλότερα στον χυμό με τα ακινητοποιημένα κύτταρα L. rhamnosus OLXAL-1 σε κομμάτια μήλου έναντι των δειγμάτων με τα ελεύθερα κύτταρα και των δειγμάτων ελέγχου. Στα προϊόντα ζυμωμένου κρέατος (αλλαντικά αέρος), τα επίπεδα των LAB κυμάνθηκαν > 8.5 log CFU/g έως τις 90 ημέρες σε όλα τα προϊόντα κατά την αποθήκευση σε θερμοκρασία ψυγείου, με μοναδική εξαίρεση τα προϊόντα της ομάδας ελέγχου που παρασκευάστηκαν με προσθήκη αποκλειστικά εμπορικής καλλιέργειας (BessaSTART) και στα οποία τα κυτταρικά επίπεδα των LAB μειώθηκαν σημαντικά ήδη από τις 30 ημέρες αποθήκευσης, μείωση που συνεχίστηκε έως 90 ημέρες (τελική συγκέντρωση LAB 7.67 log CFU/g. Μετά από εσκεμμένη επιμόλυνση των αλλαντικών αέρος με Salmonella spp., τα κυτταρικά επίπεδα του παθογόνου μειώθηκαν σημαντικά, σε σχέση με τα αντίστοιχα αρχικά επίπεδα (> 4 log CFU/g), ήδη από την 2η ημέρα ωρίμανσης σε όλες τις ομάδες προϊόντων και κυμάνθηκαν μεταξύ 3.24 – 3.74 log CFU/g. Η μείωση των επιπέδων του παθογόνου παρατηρήθηκε και στις επόμενες δειγματοληψίες κατά την περίοδο της ωρίμανσης (ημέρες 5, 10 & 15) και στις ομάδες προϊόντων που παρασκευάστηκαν με προσθήκη εμπορικής εναρκτήριας καλλιέργειας BessaSTART + ελεύθερα κύτταρα L. rhamnosus OLXAL-1 και με προσθήκη εμπορικής εναρκτήριας καλλιέργειας BessaSTART + ελεύθερα κύτταρα L. rhamnosus OLXAL-1 + σκόνη πρωτεΐνης τυρογάλακτος παρατηρήθηκαν επίπεδα χαμηλότερα από το όριο ανίχνευσης κατά το τέλος της ωρίμανσης (ημέρα 15). Αντίθετα, στα προϊόντα των ομάδων με προσθήκη εμπορικής εναρκτήριας καλλιέργειας BessaSTART και με προσθήκη εμπορικής εναρκτήριας καλλιέργειας BessaSTART + σκόνη πρωτεΐνης τυρογάλακτος, όπου δεν υπήρξε προσθήκη του δυνητικά προβιοτικού στελέχους L. rhamnosus OLXAL-1, αλλά και στην περίπτωση της ομάδας προϊόντων που παρασκευάστηκαν με προσθήκη εμπορικής εναρκτήριας καλλιέργειας BessaSTART + ακινητοποιημένα κύτταρα L. rhamnosus OLXAL-1 σε πρωτεΐνη τυρογάλακτος, τα κυτταρικά επίπεδα Salmonella spp. προσδιορίστηκαν > 2.72 log CFU/g. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της NGS ανάλυσης, τo φύλο Firmicutes προσδιορίστηκε ως το επικρατέστερο σε όλες τις ομάδες προϊόντων, με ποσοστά > 95.48%, ενώ ανιχνεύτηκαν μικρότερες σχετικές αφθονίες του φύλου Proteobacteria, σε ποσοστά < 4.52%. Σε επίπεδο γένους, προσδιορίστηκαν 13 διαφορετικά βακτηριακά γένη, εκ των οποίων τα επικρατέστερα ήταν Lactobacillus (49.53% – 80.47%), Leuconostoc (11.84 % - 16.53%) και Staphylococcus (1.27% - 32.65%), στα οποία συμπεριλαμβάνονται και οι εναρκτήριες καλλιέργειες που χρησιμοποιήθηκαν για την ωρίμανση των αλλαντικών αέρος, ενώ παράλληλα επιβεβαιώθηκε και η παρουσία του γένους Salmonella spp. σε όλες τις ομάδες προϊόντων σε σχετικές αφθονίες < 4%. Συνοψίζοντας, κυριότερα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσαν: (α) η απομόνωση, ο βιοχημικός και μοριακός χαρακτηρισμός του μοναδικού αγρίου τύπου στελέχους Lacticaseibacillus rhamnosus OLXAL-1 με πιθανές λειτουργικές ιδιότητες στη διαχείριση του ΣΔτ1, (β) η μελέτη αξιοποίησης αγρο-βιομηχανικών αποβλήτων και υπολειμμάτων τροφίμων για την παραγωγή κυτταρικής βιομάζας λειτουργικών καλλιεργειών, (γ) η παραγωγή εμπορικών "έτοιμων προς χρήση" ξηρών ακινητοποιημένων ευεργετικών καλλιεργειών σε φυσικούς φορείς για χρήση ως λειτουργικά συστατικά τροφίμων με δυνητικά ευεργετικά οφέλη στη ρύθμιση της εντερικής δυσβίωσης που παρατηρείται τον ΣΔτ1 και (δ) η παραγωγή νέων προϊόντων διατροφής με λειτουργικές καλλιέργειες, παρατεταμένη διάρκεια ζωής και αυξημένη μικροβιακή ασφάλεια.