Ταυτοποίηση αναστολέων πρωτεϊνικών κινασών που καταστέλλουν τη βιωσιμότητα των μολυσμένων από τον ιό EBV Β λεμφοκυττάρων

Abstract

Epstein-Barr virus (EBV) is a human c-herpesvirus that infects B lymphocytes as well as epithelial cells. Latent EBV infection is associated with several malignancies of B lymphocytes that include Burkitt’s lymphomas, Hodgkin’s lymphomas, AIDS-associated lymphomas, and post-transplantation lymphoproliferative disorders (PTLDs). In vitro, EBV can transform resting B cells into longterm proliferating lymphoblastoid cell lines (LCLs). LCLs display type III latency, in which a limited set of viral genes is expressed. This set includes six EBV nuclear antigens (EBNA 1, 2, 3A, 3B, 3C and-LP), three membrane proteins (LMP1, LMP2A and LMP2B), two short non-polyadenylated RNAs (EBER1 and EBER2) and transcripts from the BamHI A region of EBV (BARTs).The process of B lymphocyte transformation by EBV relies on the usurpation of cellular growth promoting and antiapoptotic signaling pathways by viral proteins. For example, LMP2A mimics and modulates the signaling pathway of B-cell antigen receptor (BCR), whereas the LMP1 oncoprotein mimics a constitutively active CD40 receptor. These signaling pathways involve a number of protein kinases, which are functionally modulated by the activity of latent EBV antigens. Extracellular signal-regulated kinases (ERKs) as well as several protein tyrosine kinases (PTKs), including those of Src family (such as Fyn, Lyn, Lck and cSrc), are some of the proteins that are activated by these EBV antigens. In an effort to identify small molecule inhibitors of the growth of EBV-transformed B lymphocytes a library of 214 kinase inhibitors was screened. This effort identified two tyrosine kinase inhibitors, PP2 and compound 5, and two MEK inhibitors, PD198306 and Cl-1040, that reduced preferentially the viability of EBV-infected human B lymphocytes and this reduction was associated with the initiation of apoptosis. Each of the four inhibitors decreased the phosphorylation of its kinase target. Moreover, the use of Lck protein specific inhibitor Α-770041, as well as Lck gene silencing experiments showed that the inhibition of Lck gene expression had a negative impact on the viability of the EBV positive cell lines, implying that Lck protein could be a possible target of PP2 and compound 5. In a similar way, silencing of MEK-1 gene negatively affected the viability of the EBV positive cell lines. These findings highlight the possible dependence of EBV-infected B lymphocytes on specific kinase-regulated pathways underlining the potential for the development of small molecule-based therapeutics that could target selectively EBV-associated human B lymphocyte malignancies.

Ο ιός Epstein-Barr (EBV) είναι ένας γ-ερπητοϊός που μολύνει τα Β λεμφοκύτταρα και τα επιθηλιακά κύτταρα του ανθρώπου. Η λανθάνουσα μόλυνση του EBV σχετίζεται με διάφορους τύπους καρκίνου των Β λεμφοκυττάρων, όπως το λέμφωμα του Burkitt, το λέμφωμα του Hodgkin, τα σχετιζόμενα με το AIDS λεμφώματα και η μετα-μεταμοσχευτική λεμφοϋπερπλαστική διαταραχή (PTLDs). In vitro, ο EBV μπορεί να μετασχηματίσει τα Β λεμφοκύτταρα μνήμης σε λεμφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές (LCLs). Στις σειρές αυτές ο ιός έχει εγκαταστήσει λανθάνουσα μόλυνση τύπου ΙΙΙ, κατά την οποία εκφράζεται μια μικρή ομάδα ιικών γονιδίων: έξι πυρηνικά αντιγόνα (EBNA 1, 2, 3A, 3B, 3C και LP), τρεις διαμεμβρανικές πρωτεΐνες (LMP1, LMP2Α και LMP2B), δύο μη πολυαδενυλιωμένα μόρια RNA (EBER-1 και EBER-2) και μόρια RNA από την BamHI Α περιοχή του ιού (BARTs).Ο μετασχηματισμός των Β λεμφοκυττάρων από τον EBV στηρίζεται στην εκμετάλλευση από τις ιικές πρωτεΐνες, κυτταρικών μονοπατιών μεταγωγής σήματος που ενεργοποιούν την ανάπτυξη ή αναστέλλουν την απόπτωση. Για παράδειγμα, η LMP2A πρωτεΐνη μιμείται τη συμπεριφορά των υποδοχέων BCR των Β λεμφοκυττάρων, ενώ η LMP1 ογκοπρωτεΐνη λειτουργεί ως ένας συνεχώς ενεργοποιημένος CD40 υποδοχέας. Τα κυτταρικά αυτά μονοπάτια περιλαμβάνουν πολλές πρωτεϊνικές κινάσες, η λειτουργία των οποίων ελέγχεται πλέον από τις ιικές πρωτεΐνες. Στις κινάσες αυτές ανήκουν οι ERKs, καθώς και διάφορες κινάσες τυροσίνης, μεταξύ των οποίων και αυτές της οικογένειας Src (όπως οι Fyn, Lyn, Lck and cSrc).214 αναστολείς κινασών, όλοι μέλη μιας βιβλιοθήκης, ελέγχθηκαν με σκοπό να ταυτοποιηθούν μικρού μεγέθους αναστολείς της ανάπτυξης των μετασχηματισμένων με τον EBV Β λεμφοκυττάρων. Βρέθηκαν δύο αναστολείς κινασών τυροσίνης, οι PP2 and compound 5, καθώς και δύο αναστολείς των ΜΕΚ πρωτεϊνών, οι PD198306 and Cl-1040, που ανέστειλαν εκλεκτικά τη βιωσιμότητα των μολυσμένων με τον EBV Β λεμφοκυττάρων. Η μείωση αυτή συσχετίστηκε με την έναρξη της απόπτωσης. Καθένας από τους τέσσερις παραπάνω αναστολείς προκάλεσε μείωση στο επίπεδο της φωσφορυλίωσης της κινάσης - στόχου. Επιπλέον, τόσο η χρήση του ειδικού για την Lck αναστολέα Α-770041, όσο και πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης του Lck γονιδίου έδειξαν ότι η αναστολή της έκφρασης της Lck πρωτεΐνης επέδρασσε αρνητικά στη βιωσιμότητα των μολυσμένων με τον EBV κυτταρικών σειρών. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι η Lck πρωτεΐνη θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός στόχος των αναστολέων PP2 και compound 5. Με τον ίδιο τρόπο η αποσιώπηση του MEK-1 γονιδίου επηρέασε αρνητικά τη βιωσιμότητα των μολυσμένων με τον EBV κυτταρικών σειρών. Τα παραπάνω ευρήματα υπογραμμίζουν την πιθανή εξάρτηση των μολυσμένων με τον EBV Β λεμφοκυττάρων από μονοπάτια μεταγωγής σήματος που ελέγχονται από συγκεκριμένες κινάσες, υπογραμμίζοντας τη δυνατότητα ανάπτυξης θεραπειών με τη χρήση μικρών μορίων, που θα μπορούσαν να στοχεύσουν επιλεκτικά τις σχετιζόμενες με τον EBV κακοήθειες των Β λεμφοκυττάρων.