The role of PD-1 in macrophage polarization and fate commitment

Abstract

Background: PD-1 is a checkpoint receptor that has been shown to inactivate T cells through SHP-2 recruitment. However, tumor bearing mice with conditional deletion of SHP-2 in T cells did not demonstrate any differences in tumor progression compared to wild type mice. Both PD-1 and SHP-2 are also expressed in myeloid cells, including the myeloid cells progenitors. PD-1 deletion in myeloid cells can induce differentiation of myeloid progenitors towards mature myeloid cells, while SHP-2 gain- of-function mutations are known to be implicated in Acute Myelogenous Leukemia, by preventing differentiation, through dephosphorylation of IRF-8 and HOXA10. Nevertheless, no PD-1/SHP- 2 interaction has been described in primary healthy myelocytes. The goal of this study, is to investigate the PD-1 / SHP-2 interaction in myeloid cells in the context of tumor and the role of this axis in myeloid cell fate commitment and anti-tumor immunity. Methods: We generated mice with conditional deletion of Ptpn11 gene (encoding for Shp-2) in myeloid cells (Shp2f/fLysMCre), or T cells (Shp2f/fLckCre) and used Shp2f/f mice as control. We also used mice with myeloid-specific deletion of the Pdcd1 gene (encoding for PD-1). Tumor cells were injected subcutaneously and tumor growth was monitored. We used two different tumor cell lines: MC17- 51 fibrosarcoma and B16-F10 melanoma. At termination, tumors, spleens and bone marrows were collected, processed (details below), and immune populations were identified by flow cytometry. For cell isolation we used Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) and magnetic beads and for signaling studies we used bone marrow cells cultured with GM-CSF and IL-3. Results: Mice with myeloid-specific SHP-2 ablation had significantly decelerated tumor growth compared to mice with T cell-specific SHP-2 ablation or control mice, but did not gain extra benefit from PD-1 blockade. SHP-2 deletion in myeloid cells resulted in T cell activation and myeloid cell activation and differentiation, while MDSCs had diminished suppressive properties and monocytes acquired lasting anti-tumor properties. Furthermore, by using RNA sequencing and gene set enrichment analysis in TAMs and PMN MDSCs, we demonstrated that SHP-2 deletion enriched gene pathways related to activation, differentiation, phagocytosis and antigen presentation in both these myeloid cell types. Myeloid specific PD-1 ablation had very similar effects in T cells and myeloid cells, and RNAseq of PD-1 deficient TAMs showed greater than 50% overlap in gene expression with SHP-2 deficient TAMs. Furthermore, we determined that in myeloid cells, GM-CSF induced phosphorylation of PD-1, recruited SHP-2 to the GM-CSF receptor and facilitated PD-1-SHP-2 interaction. Finally, either PD-1 or SHP-2 deletion enhanced GM-CSF-depended myeloid differentiation by abrogating SHP-2 medicated dephosphorylation of IRF8 and HOXA10. Conclusion: With the current study, we showed that PD-1-SHP-2 interaction can play a role in the differentiation of bone marrow myelocytes and myeloid cell progenitors and, subsequently, can affect their function and anti-tumor immunity.

Εισαγωγή: Το μόριο προγραμματισμένου θανάτου-1 (PD-1) είναι ένας υποδοχέας των σημείων ελέγχου του ανοσοποιητικού συστήματος, ο οποίος απενεργοποιεί τα Τ κύτταρα δια μέσου του SHP-2. Παρ’ όλ’ αυτά, η στοχευμένη διαγραφή του SHP-2 στα Τ κύτταρα σε ποντίκια με καρκινικούς όγκους δεν έδειξε κάποια διαφορά στην εξέλιξη των όγκων σε σχέση με τα ποντίκια στην ομάδα ελέγχου. Το PD-1, όπως και το SHP-2, εκφράζονται επίσης και στα μυελοκύτταρα, συμπεριλαμβανομένων και των πρώιμων μυελοκυττάρων στον μυελό των οστών. Η διαγραφή του PD-1 προκαλεί τη διαφοροποίηση των πρώιμων μυελοκυττάρων σε ώριμα μυελοκύτταρα. Αντιθέτως, μεταλλάξεις αυξημένης λειτουργικότητας του SHP-2 εμποδίζουν την διαφοροποίηση των μυελοκυττάρων μέσω της αποφωσφορυλίωσης του IRF-8 και του HOXA10, και ως εκ τούτου εμπλέκεται στην Οξεία Μυελογενή Λευχαιμία. Η αλληλεπίδραση του PD-1 με το SHP-2 δεν έχει ποτέ μελετηθεί στα μυελοκύτταρα. Ο σκοπός αυτής της μελετης είναι να διερευνήσει αυτή την αλληλεπίδραση στα φυσιολογικα μυελοκυτταρα , και να μελετησει τον ρόλο του άξονα PD-1/SHP-2 στην αντικαρκινική ανοσία. Μεθοδολογία: Δημιουργήσαμε ποντίκια με στοχευμένη διαγραφή του γονιδίου Ptpn11 (που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη SHP-2) στα μυελοκύτταρα (Shp2f/f LysMCre), ή στα Τ κύτταρα (Shp2f/fLckCre) και χρησιμοποιήσαμε τα Shp2f/f ποντίκια ως ομάδα ελέγχου. Ομοίως, χρησιμοποιήσαμε ποντίκια με στοχευμένη διαγραφή του γονιδίου Pdcd1, που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη PD-1. Χρησιμοποιήσαμε 2 διαφορετικές καρκινικές κυτταρικές σειρές: MC17-51 κύτταρα ινομυοσαρκώματος και B16-F10 κύτταρα μελανώματος. Μετά την ευθανασία των ποντικιών, οιόγκοι, οι σπλήνες και οι μυελοί των οστών απομονώθηκαν και επεξεργάστηκαν (όπως περιγράφεται πιο κάτω) και οι διάφοροι πληθυσμοί του ανοσολογικού συστήματος ταυτοποιηθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Για απομόνωση κυττάρων χρησιμοποιήσαμε κυτταρομετρία ροής ενεργοποιούμενης από φθορισμό (FACS) και μαγνητικά σφαιρίδια, και για τη μελέτη σηματοδότησης χρησιμοποιήσαμε κύτταρα μυελού των οστών σε καλλιέργεια με παράγοντα διέγερσης αποικιών από κοκκιοκύτταρα-μακροφάγα (GM-CSF) και ιντερλευκίνη 3 (IL-3).ΑποτελέσματαΤα ποντίκια με στοχευμένη διαγραφή του SHP-2 στα μυελοκύτταρα είχαν σημαντική επιβράδυνση στην ανάπτυξη του όγκου, σε σχέση με τα ποντίκια με διαγραφή του SHP-2 στα Τ κύτταρα ή τα ποντίκια της ομάδας ελέγχου, χωρίς όμως να έχουν επιπλέων όφελος όταν τους χορηγήθηκαν αναστολείς του PD-1. Η στοχευμένη διαγραφή του SHP-2 στα μυελοκύτταρα είχε ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων, την ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των μυελοκυττάρων, την άμβλυνση των κατασταλτικών ιδιοτήτων των κατασταλτικών κυττάρων της μυελικής σειράς (MDSCs) και την απόκτηση αντι-καρκινικών ιδιοτήτων μακράς διαρκείας από τα μονοκύτταρα. Επιπρόσθετα, χρησιμοποιώντας RNA-seq σε μακροφάγα που βρίσκονται μέσα στον όγκο (TAMs) και σε MDSCs με χαρακτηριστικά πολυμορφοπύρηνων, δείξαμε ότι η διαγραφή του SHP-2 ενίσχυσε τα γονιδιακά μονοπάτια που σχετίζονται με την ενεργοποίηση, διαφοροποίηση, φαγοκυττάρωση και αντιγονοπαρουσίαση από αυτά τα κύτταρα. Η στοχευμένη διαγραφή του PD-1 στα μυελοκύτταρα είχε όμοια λειτουργικά αποτελέσματα στα Τ κύτταρα και στα μυελοκύτταρα με αυτά που παρατηρήσαμε μετά από τη διαγραφή του SHP-2, ενώ RNA-seq σε TAMs από ποντίκια με στοχευμένη διαγραφή του PD-1 στα μυελοκύτταρα έδειξε περισσότεροαπό 50% επικάλυψη σε γονιδιακή έκφραση με τα TAMs που απομονώθηκαν από ποντίκια που τα στοχευμένη διαγραφή του SHP-2 στα μυελοκύτταρα. Δείξαμε επίσης ότι στα μυελοκύτταρα, η φωσφορυλίωση του PD-1 από το GM-CSF στρατολόγησε το SHP-2 και οδήγησε σε αλληλεπίδραση PD-1-SHP-2. Τέλος, η διαγραφή είτε του PD-1, είτε του SHP-2 ειχε σαν συνεπεια τη διαφοροποίηση των μυελοκυττάρων μέσω της καταστολής της αποφωσφορυλίωσης του IRF8 και του HOXA10 από το SHP-2. Συμπέρασμα: Με την μελέτη αυτή, αποδείξαμε ότι η αλληλεπίδραση του PD-1 με το SHP-2 σε κύτταρα της μυελικής σειράς , παίζει ρόλο στη διαφοροποίηση και την ενεργοποίηση τους, και ως εκ τούτου μπορεί να επηρεάσει την αντικαρκινική ανοσία.