Microbial synthesis of platform chemicals via crude glycerol valorization: enhanced production of 2,3-butanediol

Abstract

Humanity is on the verge of transitioning from a fossil-resource based economy to a biobased economy. The development of petrochemical substitutes within the context of sustainable and biobased processes, has attracted considerable scientific and industrial interest. Biodiesel, a fuel petrochemical substitute, has witnessed a surge in industrial application and production over recent years. Biodiesel production generates glycerol (Gly), as the main by-product of the process, with 1 kg of glycerol being produced for every 9 kg of biodiesel. It is estimated that ~65% of the global glycerol market is supplied by the biodiesel production, and with the enormous glycerol glut that has been observed the last years into the market volume, the valorisation of glycerol through microbial and/or chemical conversions presents enormous interest. The implementation of biodiesel derived glycerol as a microbial feedstock for the production of valuable biochemicals can be categorised as one of the most important topics in the field of white/industrial biotechnology. This PhD thesis presents original and novel research related to the biotechnological production of value added biochemicals, through the valorisation of biodiesel derived glycerol. A range of bacterial strains, culture conditions, aeration and feeding strategies, whole cell bacterial culture types, as well as new downstream methods were employed in order to investigate and optimise the production of valuable metabolites, such as 2,3-butanediol (BDO), acetoin, and 1,3-propanediol (PDO). The production of BDO from the strain K. oxytoca ACA-DC 1581 was optimised and carried out on both pilot-scale and on continuous system, while BDO was successfully separated from the medium. The initial phase of the study was dedicated to the investigation of novel wild-type bacteria with the capacity to assimilate biodiesel-derived glycerol at low purity (75% w/w) and produce extracellular platform biochemical compounds of major interest. The screening of 12 bacterial strains under different culture conditions (e.g., pH, O2 availability, glycerol purity) yielded in the identification of the potential of several microbial strains with high capability for the production of BDO, PDO, ethanol (EtOH) and acetoin. In the aerobic regime, the newly studied strain Klebsiella oxytoca ACA-DC 1581 exhibited a high potential for the production of BDO in high yield of BDO production to glycerol consumption (YBDO/Gly = 0.46 g/g, corresponding to 94% of the maximum theoretical yield; Ymt) and titre. Under anaerobic conditions, the strain Citrobacter freundii NRRL-B 2645 produced PDO (YPDO/Gly = 0.56 g/g, 93% of Ymt) and it was found that pH regulation was essential, due to lactic acid production and a subsequent drop in pH, which resulted in fermentation ceasing. A new wild studied strain belonging to Enterobacter ludwigii, a species that has not been extensively studied in relation to glycerol assimilation, produced EtOH with high product specificity, resulting in YEtOH/Gly = 0.44 g/g, which is 88% of Ymt. Aerobic cultures of Bacillus subtilis ACA-DC 1176, revealed its potential for both acetoin and BDO production. Furthermore, for the first time in the literature, a strain from the species Hafnia alvei (viz., Hafnia alvei ACA-DC 1196) was reported as a potential BDO producer. In fed-batch bioreactor trials, the culture of K. oxytoca led to a BDO titre of almost 70 g/L, with a YBDO/Gly of 0.47 g/g and a mean productivity value (PrBDO) of 0.40 g/L/h, while no optimisation was imposed. The bioprocess displayed potential for improvement in terms of productivity. The final BDO production obtained by this wild strain (K. oxytoca) is among the highest in the literature. In the second and fourth parts of the study, the production and recovery of BDO through biodiesel derived glycerol valorisation by Klebsiella oxytoca ACA-DC 1581 was studied. The BDO production was holistically optimized regarding the efficiency and cost of the bioprocess. A new culture medium was developed to utilise by-products/wastes and alternative more cost-effective sources of nitrogen, including corn steep liquor, biogas digestate and other low-cost inorganic nitrogen compounds. A new pre-culture medium was studied, as well as a new method of aeration (e.g., two-stage aeration) and pH adjustment. Following optimisation of these parameters, four new fed-batch cultures were performed in a bioreactor system. This stage of optimisation demonstrated that the absence of thermal treatment of the substrate had no negative effect upon the growth of K. oxytoca and the bioconversion of crude glycerol into BDO. This enabled the development of a non aseptic and lower-cost bioprocess. Both digestate and corn steep liquor (CSL), the main by-products of the biogas and corn industries respectively, were successfully employed as the sole source of nitrogen, thereby enabling the complete replacement of more expensive sources (e.g., yeast extract). The biochemical pathway of glycerol catabolism was examined under varying concentrations of dissolved oxygen, with the objective of optimising BDO production in a fully aerobic environment (volumetric mass transfer coefficient; kLa =70.5 1/h.). After optimisation and during the first 48 h of the most successful fed-batch culture, BDO productivity increased by 2.5 times (to c. 1.12 g/L/h) and the glycerol consumption rate reached 2.80 g/L/h. The YBDO/Gly was =0.46 g/g while the ratio of BDO to the sum of metabolic products was 96.3%, indicating a high selectivity of the bioprocess for BDO production. These values are among the highest ones reported in the literature for wild-type strains cultivated on crude glycerol. In all fed-batch cultures, the final BDO and acetoin concentrations reached ~80 g/L, while a plateau was observed at ~68 g/L of BDO. The next step involved the upscaling of the optimized bioprocess was successfully carried out in a pilot-scale reactor (250-L) at the Verd S.A. biodiesel plant in Velestino, Greece. Concurrently, a downstream process was developed in which salting-out extraction (SOE), consisting of ethanol (24%) and K2HPO4 (25%), recovered 91.7% of BDO from the culture medium. Further investigation is required into the partition coefficient of the unconsumed glycerol, as it was equally distributed in both phases and was studied for the first time in a glycerol-based medium. The product inhibition observed at BDO concentrations of ~65 g/L suggests the need for the development of an alternative type of culture in order to increase the rates and the yield of this bioprocess. Consequently, a continuous culture was developed, in which various dilution rates and inlet glycerol concentrations of the culture medium were employed. Among those tested, the dilution rate of 0.04 1/h demonstrated the highest values. The BDO productivity was 2.17 g/L/h, the glycerol consumption rate was 4.71 g/L/h, and the YBDO/Gly was 0.46 g/g, while the BDO titre reached 52.0 g/L. This is the first time that continuous production of BDO from glycerol has been reported and the obtained values are the highest ones of BDO production from glycerol fermentation that have been documented to date. Microscopic observation of the strain during continuous culture revealed a change in morphological level of the cell. After 80 days of culture, rod-shaped bacteria of K. oxytoca transformed into a filamentous form, which may be considered an adaptation mechanism for the highlevel growth of the cell under high levels of BDO concentration.The final phase of this study was dedicated to the investigation of the conditions that favour the production of acetoin by Bacillus subtilis. B. subtilis ACA-DC 1176, exhibited the most promising capacity for acetoin production when compared to B. subtilis ACA-DC 1225. Anaerobic cultures were found to inhibit cell growth, with cell dry weight being lower than 2 g/L. Additionally, a biofilm was observed to form in response to harsh and stressful conditions, such as the low dissolved oxygen concentration. In contrast, different results were observed under aerobic culture optimisation regarding the ratio of acetoin to BDO concentration. The impact of aeration and feeding strategy on acetoin production, demonstrated that only following glycerol depletion was acetoin and BDO converted to acetic acid. Based on the results, it is conceivable that a quantity of BDO was initially converted to acetoin for the generation of NADH. Subsequently, in the absence of an available carbon source, BDO and acetoin (in some cases) were converted to acetic acid in order to generate ATP to meet the energy needs of the cell. In the entire chapter, the maximum titre of acetoin and yield of acetoin produced on glycerol consumed obtained were 25.5 g/L and 0.27 g/g, respectively. To the best of our knowledge this is one of the very few studies investigating acetoin production using crude glycerol, as a sole substrate. The strains and the methodology proposed in this study can contribute to the development of a biorefinery that complements the manufacture of biofuels and the corn industry with high-value biobased chemicals. The study presents novel findings regarding the mechanism affecting the BDO and acetoin production. The part focused on BDO production, suggests the potential industrialisation of the bioprocess through sustainable, continuous, and low-cost bioconversion of biodiesel-derived crude glycerol and CSL or digestate into BDO. The BDO titre, productivity and YBDO/Gly achieved are the highest in the literature concerning growth of wild-type bacterial strains on crude glycerol.

Η ανθρωπότητα βρίσκεται στα πρόθυρα της μετάβασης από την βασισμένη στα ορυκτά καύσιμα οικονομία σε αυτή της βιοοικονομίας. Η ανάπτυξη πετροχημικών υποκατάστατων στο πλαίσιο βιώσιμων βιοδιεργασιών έχει προσελκύσει μεγάλο ενδιαφέρον τόσο από την ακαδημία όσο και από τη βιομηχανία. Το βιολογικό πετρέλαιο (βιοντίζελ), το οποίο είναι ένα υποκατάστατο πετροχημικών καυσίμων, παρουσίαση ραγδαία ανάπτυξη τις 3 τελευταίες δεκαετίες. Η παραγωγή του βιοντίζελ συνεπάγεται την ταυτόχρονη παραγωγή γλεκερόλης (Γλυκ), ως το κύριο παραπροϊόν της διεργασίας, καθώς ~1 kg αυτής παράγεται για κάθε ~9 kg βιοντίζελ. Εκτιμάται ότι το ~65% της παγκόσμια παραγωγής γλυκερόλης προέρχεται από την παραγωγή βιοντίζελ, με αποτέλεσμα την υπεραφθονία αυτής στην παγκόσμια αγορά. Η αξιοποίηση της γλυκερόλης μέσω μικροβιακών ή/και χημικών μετατροπών παρουσιάζει έντονο οικονομικό και περιβαλλοντικό ενδιαφέρον. Η χρήση της γλυκερόλης, προερχόμενης από το βιοντίζελ, ως υλικό εκκίνησης για μικροβιακές καλλιέργειες με σκοπό την παραγωγή υψηλής αξίας βιοχημικών μπορεί να χαρακτηριστεί ως ένα από τα σημαντικότερα θέματα στον τομέα της λευκής/βιομηχανικής βιοτεχνολογίας. Η παρούσα διδακτορική διατριβή παρουσιάζει την πρωτότυπη μελέτη της βιοτεχνολογικής παραγωγής βιοχημικών προϊόντων προστιθέμενης αξίας, μέσω της αξιοποίησης ακάθαρτης γλυκερόλης, η οποία προέρχεται από την παραγωγή βιοντίζελ. Για τη διερεύνηση και την αριστοποίηση παραγωγής πολύτιμων μεταβολιτών, όπως η 2,3-βουτανοδιόλης (ΒΔΟ), η ακετοΐνη και η 1,3-προπανοδιόλη (ΠΔΟ), μελετήθηκε ένα εύρος βακτηριακών στελεχών, συνθηκών καλλιέργειας, στρατηγικών αερισμού και τροφοδοσίας, τύπων καλλιέργειας και μεθόδων ανάκτησης προϊόντος από το μέσο καλλιέργειας. Η παραγωγή ΒΔΟ από το βακτήριο Klebsiella oxytoca ACA-DC 1581 αρχικά αριστοποιήθηκε σε ημι-συνεχές εργαστηριακή κλίμακα, και στη συνέχεια αναπτύχθηκε σε συνεχές σύστημα και σε πιλοτική κλίμακα. Μετά το πέρας της καλλιέργειας, η παραχθείσα ΒΔΟ ανακτήθηκε από το θρεπτικό μέσο καλλιέργειας. Στο αρχικό στάδιο της μελέτης διερευνήθηκαν βακτήρια άγριου τύπου με μεταβολικούς μηχανισμού αφομοίωσης ακατέργαστης γλυκερόλης (καθαρότητας 75% w/w), η οποία προέρχεται από την παραγωγή βιοντίζελ, προς παραγωγή εξωκυτταρικών βιοχημικών ενώσεων μείζονος ενδιαφέροντος. Η μελέτη 12 βακτηρίων υπό διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας (π.χ. pH, διαθεσιμότητα Ο2, καθαρότητα γλυκερίνης) οδήγησε στην εύρεση αρκετών μικροβιακών στελεχών με υψηλή ικανότητα ως προς την παραγωγή ΒΔΟ, ΠΔΟ, αιθανόλης, και ακετοΐνης. Υπό αερόβιες συνθήκες, το πρώτη φορά μελετηθέν στέλεχος K. oxytoca ACA-DC 1581 παρουσίασε υψηλή δυναμική παραγωγής ΒΔΟ. Ο συντελεστής της παραχθείσας ΒΔΟ ως προς την καταναλωθείσα γλυκερόλη (YΒΔΟ/Γλυκ) ήταν 0,46 g/g, ήτοι το 94% της μέγιστης θεωρητικής απόδοσης (Yμθ). Υπό αναερόβιες συνθήκες, το στέλεχος Citrobacter freundii NRRL-B 2645 παρήγαγε ΠΔΟ (YΠΔΟ/Γλυκ = 0,56 g/g, 93% του Ymt) σε περιβάλλον ρυθμιζόμενου pH, λόγω της παραγωγής γαλακτικού οξέος. Ο μικροοργανισμός Enterobacter ludwigii FMCC-204, ο οποίος δεν έχει μελετηθεί εκτενώς σε σχέση με την αφομοίωση της γλυκερόλης, παρήγαγε αιθανόλη με υψηλή εκλεκτικότητα και ο YΑΙΘΑΝ/Γλυκ ήταν 0.44 g/g, δηλαδή 88% του Yμθ. Οι αερόβιες καλλιέργειες του Bacillus subtilis ACA-DC 1176, υποδεικνύουν τη δυναμική του για παραγωγή ακετοΐνης και ΒΔΟ. Παράλληλα, για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία, ένα στέλεχος από το είδος Hafnia alvei (Hafnia alvei ACA-DC 1196) αναφέρεται για την ικανότητά του να παράξει ΒΔΟ. Η ημι-συνεχής καλλιέργεια σε βιοαντιδραστήρα του K. oxytoca οδήγησε στην παραγωγή ΒΔΟ ίση με 70 g/L, με YΒΔΟ/ΓΛΥΚ 0,47 g/g και μέση τιμή παραγωγικότητας (PrBDO) 0,40 g/L/h, χωρίς να έχει πραγματοποιηθεί καμία τεχνική/μέθοδος βελτιστοποίησης. Ως εκ τούτου, η παρούσα βιοδιεργασία παρουσίασε ενδιαφέρον για βελτιστοποίηση της παραγωγικότητας και μείωση του κόστους. Η τελική συγκέντρωση ΒΔΟ που επιτυγχάνεται από αυτό το άγριο στέλεχος (K. oxytoca) είναι από τις υψηλότερες στη βιβλιογραφία.Κατά το δεύτερο και τέταρτο μέρος της μελέτης, διερευνήθηκε η παραγωγή και ανάκτηση της ΒΔΟ, μέσω της αξιοποίησης ακάθαρτης γλυκερόλης, προερχόμενης από την παραγωγή του βιοντίζελ, από τον μικροοργανισμό K. oxytoca ACA-DC 1581. Η παραγωγή της ΒΔΟ βελτιστοποιήθηκε ολιστικά όσον αφορά την παραγωγικότητα και το κόστος της βιοδιεργασίας. Αναπτύχθηκε ένα νέο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας για την αξιοποίηση πάρα-προϊόντων και εναλλακτικών πηγών αζώτου, συμπεριλαμβανομένων του παραπροϊόντος της υγρής άλεσης καλαμποκιού, του υγρού χωνεμένου παραπροϊόντος της παραγωγής βιοαερίου και άλλων ανόργανων ενώσεων αζώτου χαμηλού κόστους. Ταυτόχρονα, μελετήθηκε η σύσταση του θρεπτικού μέσου της προ-καλλιέργειας, η στρατηγική αερισμού (π.χ. αερισμός δύο σταδίων) και ρύθμισης του pH της καλλιέργειας. Κατόπιν της βελτιστοποίησης των παραπάνω, πραγματοποιήθηκαν τέσσερις νέες ημισυνεχείς καλλιέργειες σε βιοαντιδραστήρα. Το παρόν στάδιο βελτιστοποίησης της βιοδιεργασίας υπέδειξε ότι η απουσία θερμικής επεξεργασίας του θρεπτικού μέσου δεν είχε αρνητική επίδραση στην ανάπτυξη του μικροοργανισμού K. oxytoca και στη βιομετατροπή της ακατέργαστης γλυκερόλης σε ΒΔΟ. Επομένως, κρίνεται εφικτή η ανάπτυξη μιας μη ασηπτικής διεργασίας χαμηλότερου κόστους. Τόσο το υγρό χωνεμένο παραπροϊόν της παραγωγής βιοαερίου όσο και το παραπροϊόν της υγρής άλεσης καλαμποκιού, ήτοι τα κύρια παραπροϊόντα των βιομηχανιών καλαμποκιού και βιοαερίου αντίστοιχα, χρησιμοποιήθηκαν με επιτυχία ως μοναδική πηγή αζώτου, επιτρέποντας έτσι την πλήρη αντικατάσταση ακριβότερων πηγών (π.χ. εκχύλισμα ζύμης). Το βιοχημικό μονοπάτι σχετιζόμενο με τον καταβολισμό της γλυκερόλης εξετάστηκε υπό ποικίλες συγκεντρώσεις διαλυμένου οξυγόνου, με στόχο τη βελτιστοποίηση της παραγωγής ΒΔΟ σε πλήρως αερόβιο περιβάλλον (ογκομετρικός συντελεστής μεταφοράς μάζας- kLa =70,5 1/h.). Μετά τη βελτιστοποίηση και κατά τη διάρκεια των πρώτων 48 ωρών της πιο επιτυχημένης ημι-συνεχούς καλλιέργειας, η παραγωγικότητα της ΒΔΟ αυξήθηκε κατά 2,5 φορές (1,12 g/L/h) και ο ρυθμός κατανάλωσης γλυκερόλης έφθασε τα 2,80 g/L/h. Ο YΒΔΟ/Γλυκ ήταν 0,46 g/g, ενώ ο λόγος της ΒΔΟ προς το σύνολο των μεταβολικών προϊόντων ήταν 0,96 g/g, υποδεικνύοντας την υψηλή εκλεκτικότητα της βιοδιεργασίας προς την παραγωγή ΒΔΟ. Οι τιμές αυτές είναι από τις υψηλότερες που αναφέρονται στη βιβλιογραφία για στελέχη άγριου τύπου καλλιεργούμενα σε ακατέργαστη γλυκερόλη. Σε όλες τις ημι-συνεχείς καλλιέργειες, οι τελικές συγκεντρώσεις του αθροίσματος ΒΔΟ και ακετοΐνης έφτασαν τα ~80 g/L, ενώ παρατηρήθηκε ένα πλατώ περίπου στα 68 g/L BDO. Το επόμενο βήμα εστίασε στην αναβάθμιση της ήδη βελτιστοποιημένης βιοδιεργασίας, η οποία πραγματοποιήθηκε με επιτυχία σε αντιδραστήρα πιλοτικής κλίμακας (250-L) στο εργοστάσιο παραγωγής βιοτνίζελ της Verd S.A. στη Μαγνησία.Ταυτόχρονα, αναπτύχθηκε η διεργασία ανάκτησης της παραχθείσας ΒΔΟ από το μέσο της καλλιέργειας. Εφαρμόστηκε η μέθοδος “salting-out extraction”, στην οποία χρησιμοποιήθηκε αιθανόλη (24%) και K2HPO4 (25%) και η ανάκτηση της ΒΔΟ ήταν 91,7%. Απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση του συντελεστή κατανομής της μη καταναλισκόμενης γλυκερόλης, δεδομένου ότι ήταν ισοκατανεμημένη στις δύο φάσεις, καθώς για πρώτη φορά μελετάται σε θρεπτικό μέσο με βάση τη γλυκερόλη. Η παρεμπόδιση εκ του προϊόντος που παρατηρήθηκε σε συγκεντρώσεις ΒΔΟ ~65 g/L υποδηλώνει την ανάγκη ανάπτυξης ενός εναλλακτικού τύπου καλλιέργειας προκειμένου να αυξηθεί η απόδοση της βιοδιεργασίας. Ως αποτέλεσμα, αναπτύχθηκε μια συνεχής καλλιέργεια, στην οποία χρησιμοποιήθηκαν διάφοροι ρυθμοί αραίωσης και συγκεντρώσεις γλυκερόλης στο θρεπτικού μέσο τροφοδοσίας. Μεταξύ αυτών που δοκιμάστηκαν, ο ρυθμός αραίωσης 0,04 1/h επέδειξε τις υψηλότερες τιμές. Η παραγωγικότητα της ΒΔΟ έφθασε τα 2,17 g/L/h, ο ρυθμός κατανάλωσης γλυκερόλης ήταν 4,71 g/L/h και ο YΒΔΟ/Γλυκ ήταν 0,46 g/g, ενώ η συγκέντρωση της ΒΔΟ έφθασε τα 52,0 g/L. Πρόκειται για την πρώτη φορά που αναφέρεται η συνεχής παραγωγή ΒΔΟ από γλυκερόλη, επίσης οι τιμές που ελήφθησαν είναι οι υψηλότερες που έχουν καταγραφεί μέχρι σήμερα για την παραγωγή ΒΔΟ από αφομοίωση γλυκερόλης. Η μικροσκοπική παρατήρηση του μικροοργανισμού κατά τη διάρκεια της συνεχούς καλλιέργειας αποκάλυψε μια αλλαγή στη μορφολογία του κυττάρου. Μετά από 80 ημέρες καλλιέργειας, τα ραβδόμορφα βακτήρια του K. oxytoca απέκτησαν νηματοειδ ήμορφή, το οποίο μπορεί να ερμηνευτεί ως μηχανισμός προσαρμογής στα υψηλά επίπεδα συγκέντρωσης ΒΔΟ. Κατά το τελικό στάδιο της παρούσας μελέτης διερευνήθηκαν οι συνθήκες που ευνοούν την παραγωγή ακετοΐνης από το στελέχη του είδους Bacillus subtilis. Μεταξύ των δύο στελεχών αυτού του είδους που δοκιμάστηκαν, το B. subtilis ACA-DC 1176 επέδειξε το μεγαλύτερο δυναμικό παραγωγής ακετοΐνης. Διαπιστώθηκε ότι οι αναερόβιες καλλιέργειες αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων, με το ξηρό βάρος αυτών να είναι χαμηλότερο από 2 g/L. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ο σχηματισμός βιοϋμενίου ως απόκριση σε μη ευνοϊκές και στρεσογόνες συνθήκες, όπως η χαμηλή συγκέντρωση διαλυμένου οξυγόνου. Ο αντίκτυπος της στρατηγικής αερισμού και τροφοδοσίας προς παραγωγή ακετοΐνης, έδειξε ότι μόνο μετά την εξάντληση της γλυκερόλης η ακετοΐνη και η ΒΔΟ μετατράπηκαν σε οξικό οξύ. Είναι πιθανό ότι ένα μέρος της ΒΔΟ μετατράπηκε αρχικά σε ακετοΐνη για την παραγωγή NADH. Στη συνέχεια, ελλείψει διαθέσιμης πηγής άνθρακα, η ΒΔΟ και η ακετοΐνη (σε ορισμένες περιπτώσεις) μετατράπηκαν σε οξικό οξύ, προφανώς για την παραγωγή ΑΤΡ, ικανοποιώντας τις ενεργειακές απαιτήσεις του κυττάρου. Η μέγιστη τιμής της συγκέντρωσης ακετοΐνης και του YAΚΕΤ/Γλυκ ήταν 25,5 g/L και 0,27 g/g, αντίστοιχα. Εξ όσων γνωρίζουμε, αυτή είναι μία από τις ελάχιστες μελέτες που διερευνούν την παραγωγή ακετοΐνης με χρήση ακατέργαστης γλυκερόλης, ως πηγή άνθρακα.Τα στελέχη και η μεθοδολογία που προτείνονται στην παρούσα μελέτη μπορούν να συμβάλουν στην ανάπτυξη ενός βιοδιυλιστηρίου που συμπληρώνει τη βιομηχανία βιοκαυσίμων και καλαμποκιού με υψηλής αξίας βιοχημικά μικροβιολογικής προέλευσης. Η μελέτη παρουσιάζει νέα ευρήματα σχετικά με τον μηχανισμό που επηρεάζει την παραγωγή της ΒΔΟ και της ΑΚΕΤ. Το μέρος που επικεντρώνεται στην παραγωγή της ΒΔΟ, υποδεικνύει τη δυνατότητα βιομηχανοποίησης της βιοδιεργασίας μέσω της βιώσιμης, συνεχούς και χαμηλού κόστους βιομετατροπής της ακατέργαστης γλυκερόλης που προέρχεται από βιοντίζελ με την ταυτόχρονη αξιοποίηση του παραπροϊόντος της υγρής άλεσης καλαμποκιού και του υγρού παραπροϊόντος του βιοαερίου προς ΒΔΟ. Οι τιμές της παραγωγικότητας και του YΒΔΟ/Γλκυκ είναι οι υψηλότερες στη βιβλιογραφία σχετικά με την ανάπτυξη βακτηριακών στελεχών άγριου τύπου σε ακατέργαστη γλυκερόλη.