Τα μιτοχόνδρια ως βιοδείκτες στους γαμέτες και τα προεμφυτευτικά έμβρυα

Abstract

Among the most significant areas of contemporary biology are the linked subject areas of genetics and molecular biology. Undoubtedly, they provide tools for comprehending how individual genes, biological processes, and biosystems work. Their use in the health sciences is the catalyst for precise identification and individualized, focused therapy of many human disorders. A particular field where the knowledge of genetics and molecular biology is systematically applied is medically assisted reproduction, which is directly reliant on scientific advancements in the areas of molecular genetics, biotechnology, and biomedicine. IVF has transformed reproductive medicine and given hope to countless individuals and couples struggling with infertility. Cell-free or free DNA (cfDNA) has emerged as a promising candidate biomarker. CfDNA, composed of small DNA fragments, is essentially a double-stranded extracellular molecule, composed of nuclear and mitochondrial DNA, mainly released from the nucleus due to apoptotic or necrotic processes, has the potential to revolutionize the way we assess embryo viability in IVF procedures as it has recently been shown to be a useful biomarker in pre-implantation diagnosis. Its non-invasive nature and real-time monitoring capability make it an exciting avenue to advance the field of assisted reproductive technologies. As research advances and methodologies improve, cfDNA could become a valuable tool in the IVF process. The follicular fluid, in which free DNA is mainly found, is a suitable material for mitochondrial research as it constitutes the microenvironment necessary for the development of eggs and plays a decisive role in fertilization success and fetal development. In recent years, there has also been a trend in the study of mitochondrial biology in order to advance knowledge about the viability of preimplantation embryos created during assisted reproduction techniques. In this PhD thesis, specific aspects of mitochondrial biology of follicles examined in order to demonstrate them as potential biomarkers in clinical embryology and reproductive biology and contribute to the advancement of modern Assisted Reproductive Medicine. Since it has been shown that high levels of free DNA and especially free mitochondrial DNA may be associated with low-quality oocytes and reduced developmental potential of pre-embryos, it was considered appropriate to study their qualitative and quantitative expression, with the aim of investigating the potential clinical value of their levels. The main biological material that used was the follicular fluid, it collected from women undergoing IVF and analyzed with the real time PCR technique. Finally, we placed greater attention on the study of mitochondrial DNA, as it is thought that mitochondria represent the missing link that could relate the science of human reproduction to novel predictive and diagnostic interventions in infertility as well as potential new therapies. Our analysis showed that the level of FF-cf-mtDNA was lower in the group of of advanced- age women than in the groups of PCOS and those without any endocrine disorder. In addition, mtDNA copy number will be recorded to investigate whether this number is a reliable biomarker independent of morphology, age, aneuploidy and pre-implantation genetic testing and whether its use can lead to higher rates of successful implantation in women undergoing assisted reproduction. Furthermore, a significant positive correlation was observed between FF-cf-mtDNA and the number of mature (MII) oocytes. Based on the findings of our study, there is an apparent contradiction about the fact that the follicular mtDNA/nDNA ratio increases with age, although the number of mitochondria itself has indeed decreased. Collectively, the data show that the relative ratio of cf-mtDNA to cf-nDNA content in human follicular fluid can be an effective predictor for assessing the corresponding oocyte’s age-related performance in IVF.

Οι συγγενείς κλάδοι της γενετικής και της μοριακής βιολογίας είναι από τα σημαντικότερα πεδία της σύγχρονης βιολογίας. Αποτελούν και οι δύο αυτοί κλάδοι εργαλεία για την κατανόηση της λειτουργίας του συνόλου των γονιδίων, των βιολογικών μονοπατιών και των βιοσυστημάτων. Η εφαρμογή τους στις επιστήμες υγείας είναι η αιχμή του δόρατος για την ακριβή διάγνωση και την στοχευμένη εξατομικευμένη αντιμετώπιση πολλών νοσημάτων του ανθρώπου. Η Ιατρικώς Υποβοηθούμενη Αναπαραγωγή είναι ένα από τα πεδία που εφαρμόζονται συστηματικά οι γνώσεις της γενετικής και μοριακής βιολογίας και συνεπώς άμεσα εξαρτημένη από τις επιστημονικές εξελίξεις στους τομείς της μοριακής γενετικής, της βιοτεχνολογίας και της βιοιατρικής. Το DNA χωρίς κύτταρα ή ελεύθερο DNA (cfDNA) έχει αναδειχθεί ως ένας πολλά υποσχόμενος υποψήφιος βιοδείκτης. Το cfDNA, αποτελείται από μικρά θραύσματα DNA, είναι στην ουσία δίκλωνο εξωκυτταρικό μόριο, αποτελείται από πυρηνικό και μιτοχονδριακό DNA, απελευθερώνεται κυρίως από τον πυρήνα εξαιτίας αποπτωτικών ή νεκρωτικών διαδικασιών, έχει τη δυνατότητα να φέρει επανάσταση στον τρόπο με τον οποίο αξιολογούμε τη βιωσιμότητα του εμβρύου στις διαδικασίες εξωσωματικής γονιμοποίησης καθώς πρόσφατα έχει αποδειχθεί χρήσιμος βιοδείκτης στην προεμφυτευτική διάγνωση. Η μη επεμβατική φύση του και η δυνατότητα παρακολούθησης σε πραγματικό χρόνο το καθιστούν μια συναρπαστική οδό για την προώθηση του τομέα των τεχνολογιών υποβοηθούμενης αναπαραγωγής. Καθώς η πρόοδος και οι μεθοδολογίες της έρευνας βελτιώνονται, το cfDNA θα μπορούσε να γίνει ένα πολύτιμο εργαλείο στη διαδικασία της εξωσωματικής γονιμοποίησης. Το ωοθυλακικό υγρό, στο οποίο συναντάται κυρίως ελεύθερο DNA, αποτελεί πρόσφορο υλικό έρευνας των μιτοχονδρίων καθώς αποτελεί το μικροπεριβάλλον που είναι απαραίτητο για την ανάπτυξη των ωαρίων και διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην επιτυχία γονιμοποίησης και στην εμβρυική ανάπτυξη. Τα τελευταία χρόνια, επίσης, παρατηρείται μια τάση στην μελέτη της βιολογίας των μιτοχονδρίων με σκοπό την προαγωγή γνώσεων σχετικά με την βιωσιμότητα των προεμφυτευτικών εμβρύων που δημιουργούνται στην διάρκεια των τεχνικών υποβοηθούμενης αναπαραγωγής. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, εξετάστηκαν συγκεκριμένες πτυχές της μιτοχονδριακής βιολογίας των ωοθυλακίων με σκοπό την μελέτη τους ως πιθανών βιοδεικτών στην κλινική εμβρυολογία και τη βιολογία της αναπαραγωγής και θα συμβάλλουν στην πρόοδο της σύγχρονης Ιατρικής της Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής. Εφόσον έχει δειχθεί ότι τα υψηλά επίπεδα ελεύθερου DNA και κυρίως του ελεύθερου μιτοχονδριακού DNA μπορεί να έχουν συσχέτιση με χαμηλής ποιότητας ωάρια και μειωμένη αναπτυξιακή δυνατότητα των προεμβρύων, θεωρήθηκε σκόπιμο να μελετηθεί η ποιοτική και ποσοτική τους έκφραση, με στόχο την διερεύνηση της πιθανής κλινικής αξίας των επιπέδων τους. Το κύριο βιολογικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε είναι το ωοθυλακικό υγρό και τα κοκκώδη κύτταρα που εμπεριέχονται σε αυτό, συλλέχθηκε από γυναίκες που υποβάλλονται σε εξωσωματική γονιμοποίηση και αναλύθηκε με την τεχνική της real time PCR. Τέλος, μεγαλύτερη βαρύτητα δόθηκε στην μελέτη του μιτοχονδριακού DNA, καθώς εκτιμάται ότι τα μιτοχόνδρια είναι ο συνδετικός κρίκος που θα μπορούσε να συνδέσει την επιστήμη της ανθρώπινης αναπαραγωγής, με νέες προγνωστικές και διαγνωστικές παρεμβάσεις στην υπογονιμότητα και ενδεχομένως σε νέες θεραπείες. Η ανάλυσή μας έδειξε ότι το επίπεδο του FF-cf-mtDNA ήταν χαμηλότερο στην ομάδα των γυναικών σε προχωρημένη ηλικία από ότι στις ομάδες των γυναικών με PCOS και αυτών χωρίς κάποια ενδοκρινική διαταραχή. Επιπλέον, θα καταγραφεί ο αριθμός αντιγράφων mtDNA με σκοπό την διερεύνηση για το εάν ο αριθμός αυτός αποτελεί αξιόπιστο βιοδείκτη, ανεξάρτητο από την μορφολογία, την ηλικία, την ανευπλοειδία και τον προεμφυτευτικό γενετικό έλεγχο κι αν η χρήση του μπορεί να οδηγήσει σε υψηλότερα ποσοστά επιτυχούς εμφύτευσης σε γυναίκες που υπόκεινται σε υποβοηθούμενη αναπαραγωγή. Ακόμη, παρατηρήθηκε σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ του FF-cf-mtDNA και του αριθμού των ώριμων (MII) ωαρίων. Το κύριο ζήτημα που προέκυψε από την έρευνά μας είναι το γεγονός ότι ενώ η αναλογία mtDNA/nDNA αυξάνεται με την ηλικία της γυναίκας, ο αριθμός των μιτοχονδρίων μειώνεται με την ηλικία της γυναίκας. Συλλογικά, τα δεδομένα δείχνουν ότι η σχετική αναλογία cf-mtDNA προς περιεχόμενο cf-nDNA στο ωοθυλακικό υγρό μπορεί να είναι ένας αποτελεσματικός προγνωστικός παράγοντας για την αξιολόγηση της απόδοσης του αντίστοιχου ωοκυττάρου που σχετίζεται με την ηλικία στην εξωσωματική γονιμοποίηση.