Studying the molecular mechanisms underlying Ralstonia solanacearum and Xylella fastidiosa pathogenicity

Abstract

Plant-microbe interactions are characterized my complex molecular dialogues, mediated by specific plant and microbial molecules. To fight-off pathogens, plants rely upon their innate immunity systems. This two-layer system consist of proteinaceous receptors, known as Pattern Recognition Receptors (PRRs) and Nucleotide-binding Leucine-rich repeats Receptors (NLRs),that recognize extracellular damage- or microbe-associated molecular patterns and intracellular microbe-derived effector proteins, respectively. Many pathogens depend on their various effector-delivering mechanisms to suppress plant innate immune responses and facilitate virulence. Ralstonia solanacearum is a destructive Gram-negative phytopathogenic bacterium with a wide host range. One of the main determinants of R. solanacearum pathogenicity is its Type 3 Secretion System (T3SS) and the Type 3 Effectors (T3Es) that it injects inside plant cells. In this study three previously researched R. solanacearum T3Es were examined, in order to further investigate the molecular mechanisms underlying this pathogen’s virulence. After inspecting T3Es PopP1, RipWand RipE1 in regards with their in-planta properties and putative subcellular targets, the latter was selected as the most potent, in an attempt to elucidate a novel molecular mechanism of effect or function. This study brings to light evidence supporting that RipE1, through its predicted cysteineprotease activity, targets plant exocyst complex subunit Exo70B1 and its associated RPM1-Interacting Protein 4 (RIN4) and cause their degradation. Although no compelling signs of RipE1compromising the host’s secretion and membrane trafficking pathways were uncovered, further investigation revealed that the particular RipE1 targets appear linked to the effector’s recognition from a previously characterized NLR of the model plant species Nicotiana benthamiana. Pseudomonas tomato race 1 (Ptr1) is a typical NLR with a Coiled-coil (CC) signaling domain that has been proposed to monitor RIN4 integrity and has been shown to recognize RIN4-targetingpathogen effectors. Here, we propose a working model, according to which RipE1 causes the proteolysis-dependent degradation of the Exo70B1-RIN4 complex and this process activates Ptr1-mediated immune responses in N. benthamiana. Xylella fastidiosa is an important phytopathogenic bacterium that causes several diseases on hostsof high economic importance. Although Gram-negative, X. fastidiosa lacks a T3SS and heavily rely upon its Type 2 Secretion System (T2SS) to deliver effector proteins in the host apoplast and promote disease. Very few of X. fastidiosa putative Type 2 Effectors (T2Es) have been characterized and thoroughly studied. For this study, nineteen putative X. fastidiosa T2Es were selected to shed some light in the molecular mechanisms underlying this bacterium’s pathogenicity. The selected genes were cloned in an Agrobacterium-mediated transient expression system, which was designed to transfer the transiently expressed proteins to the apoplast. The ability of the nineteen putativeT2Es to induce cell death-like responses in the apoplast of leaves from model Nicotiana spp. plants was tested. Among them, nine T2Es were able to induce cell death-like phenotypes on Nicotianatabacum plants, while none of them displayed similar properties in N. benthamiana. Based on their predicted function, we propose that these proteins are important Cell Wall Degrading Enzymes(CWDEs) of X. fastidiosa arsenal of T2Es, typically serving to break down physical barriers of host tissues. In N. tabacum, function of these T2Es in the apoplast potentially produces Damage-Associated Molecular Patterns (DAMPs), subsequently recognized by PRRs and ultimately leading to the activation of cell death-like defense responses. Overall, the two parts of this study’s results provide novel insight into the molecular mechanisms of R solanacearum T3E and X. fastidiosa T2E effector function. Since recognition mechanisms were uncovered in both cases, these data could by some means contribute to the advancement of pursuing new resistance tools against these destructive plant pathogens.

Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ μικροβίων και φυτικών οργανισμών χαρακτηρίζονται από περίπλοκους μοριακούς διαλόγους, στους οποίους εμπλέκονται τόσο φυτικής, όσο και μικροβιακής προέλευσης μόρια. Οι φυτικοί οργανισμοί βασίζονται στο έμφυτο ανοσοποιητικό τους σύστημα,ένα σύστημα δύο επιπέδων αποτελούμενο από δύο ομάδες υποδοχέων πρωτεϊνικής φύσεως για να καταπολεμήσουν τα παθογόνα. Η πρώτη ομάδα τέτοιων υποδοχέων ονομάζονται, τους PRRs(Pattern Recognition Receptors) και είναι υπεύθυνοι για την αναγνώριση μικροβιακών μοριακών μοτίβων στο εξωκυτταρικό περιβάλλον. Τα παθογόνα εγχέουν πρωτεΐνες παθογένειας, γνωστές ως τελεστές (effectors) μέσα στο φυτικό κύτταρο για να διαταράξουν τις φυσιολογικές λειτουργίες του ξενιστή προς όφελος του παθογόνου. Οι τελεστές αναγνωρίζονται από τη δεύτερη ομάδα υποδοχέων, τους NLRs (Nucleotide-binding Leucine-rich repeats Receptors), οι οποίοι συχνά ευθύνονται για την ανθεκτικότητα ενός φυτού έναντι συγκεκριμένων παθογόνων. Η Ralstonia solanacearum είναι ένα σημαντικό φυτοπαθογόνο αρνητικό κατά Gram βακτήριο, το οποίο σε μεγάλο βαθμό βασίζεται στο σύνολο των τελεστών του για να προσβάλλει επιτυχώς τους ξενιστές του. Οι εν λόγω τελεστές εκκρίνονται μέσα στο φυτικό κύτταρο μέσω μιας βακτηριακής συσκευής έγχυσης, που ονομάζεται εκκριτικό σύστημα τύπου 3 (Type 3 Secretion System ή T3SS). Στην παρούσα διατριβή αρχικά εξετάστηκαν τρεις τελεστές τύπου 3, οι PopP1, RipW και RipE1, από το παθογόνο R. solanacearum, ως προς τις ιδιότητές τους εντός του φυτικού κυττάρου, αλλά και τους πιθανούς υποκυτταρικούς τους στόχους. Με σκοπό τη διαλεύκανση ενός νέου μοριακού μηχανισμού της λειτουργίας των τελεστών, ο τελεστής RipE1 επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης υπέδειξαν δύο νέους υποκυτταρικούς στόχους του RipE1, την υπομονάδα Exo70B1 του φυτικού συμπλόκου εξωκυττάρωσης (exocyst complex) και τη σχετιζόμενη με αυτή πρωτεΐνη RIN4 (RPM1-Interacting Protein 4). Η στόχευση των Exo70B1 καιRIN4 από τον RipE1 φάνηκε να βασίζεται στη προτεινόμενη δράση πρωτεάσης κυστεΐνης του τελεστή και να προκαλεί την αποικοδόμηση των δύο στόχων. Αν και τα ευρήματα της παρούσας έρευνας δεν υποστηρίζουν απόλυτα την εμπλοκή του τελεστή RipE1 στους εκκριτικούς μηχανισμούς του φυτικού κυττάρου, το γεγονός ότι στοχεύει τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες οδήγησε στην ανακάλυψη ενός NLR υποδοχέα που αναγνωρίζει τη δράση του. Ο NLR υποδοχέας Ptr1(Pseudomonas tomato race 1) του φυτού-μοντέλου Nicotiana benthamiana, που έχει συνδεθεί στο παρελθόν με τη ‘φρούρηση’ της ακεραιότητας της RIN4, αναδείχθηκε υπεύθυνος για την αναγνώριση της πρωτεολυτικής δράσης του RipE1. Συμπερασματικά, η παρούσα διατριβή οδήγησε στην πρόταση ενός μοντέλου που περιγράφει το μοριακό μηχανισμό αναγνώρισης του τελεστή RipE1, μέσω της αναγνώρισης της πρωτεολυτικής του δράσης επί του συμπλόκου Exo70B1-RIN4 από τον υποδοχέα Ptr1. Το φυτοπαθογόνο βακτήριο Xylella fastidiosa, αν και αρνητικό κατά Gram, δε διαθέτει T3SS. Αντιθέτως, η δική του ικανότητα να μολύνει τους ξενιστές του έχει περισσότερο συνδεθεί μετελεστές που εκκρίνονται από το εκκριτικό σύστημα τύπου 2 (Type 2 Secretion System ή T2SS).Το T2SS δεν εγχέει τελεστές στο εσωτερικό του κυττάρου του ξενιστή, αλλά τους απελευθερώνει στο φυτικό αποπλάστη. Ελάχιστοι τελεστές τύπου 2 του παθογόνου X. fastidiosa έχουν χαρακτηριστεί και μελετηθεί μέχρι σήμερα. Στην παρούσα διατριβή, επιλέχθηκαν δεκαεννέα από αυτούς για περαιτέρω μελέτη. Η μελέτη αυτή αφορούσε τη διερεύνηση της ιδιότητας των επιλεγμένων τελεστών να επάγουν αμυντική απόκριση υπό τη μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, όντας στο φυτικό αποπλάστη σε φυτά-μοντέλα του γένους Nicotiana. Για το σκοπό αυτό τα υπό μελέτη γονίδια κλωνοποιήθηκαν σε ένα σύστημα παροδικής έκφρασης μέσω Αγροβακτηρίου, με το οποίο και πραγματοποιήθηκαν δοκιμές επαγωγής του κυτταρικού θανάτου σε φύλλα των φυτών Nicotiana tabacum και Nicotiana benthamiana. Εννέα από τους υπό μελέτη τελεστές φάνηκε να ενεργοποιούν τον κυτταρικό θάνατο στο φυτό N. tabacum, ενώ για καμία από αυτές δεν έγιναν αντίστοιχες παρατηρήσεις στο φυτό N. benthamiana. Σύμφωνα με τις προβλεπόμενες λειτουργίες των συγκεκριμένων τελεστών, πρόκειται για γνωστές κατηγορίες ενζύμων που ανήκουν στα ένζυμα αποικοδόμησης κυτταρικού τοιχώματος (Cell Wall DegradingEnzymes ή CWDEs). Επομένως, είναι πιθανό η επαγωγή του κυτταρικού θανάτου να οφείλεται σε αναγνώριση μοριακών μοτίβων των δομικών κυτταρικών συστατικών που έχουν υποστεί ζημιά (Damage-Associated Molecular Patterns ή DAMPs), ένα καθιερωμένο υπόστρωμα για τους υποδοχείς PRRs. Συνολικά, τα αποτελέσματα που προκύπτουν και από τα δύο μέρη της παρούσας διατριβής φέρνουν στο φως νέες πληροφορίες για τη λειτουργία των υπό μελέτη τελεστών και την αναγνώρισή τους από το φυτικό σύστημα έμφυτης ανοσίας, συμβάλλοντας στην καλύτερη κατανόηση πιθανών μηχανισμών προστασίας έναντι σε δύο πολύ σημαντικά παθογόνα.