Study of DNA damage repair mechanisms and epigenetics in the maintenance of genome integrity: a role for histone de-ubiquitinase complexes

Abstract

Nucleotide Excision Repair (NER) and in particular the Transcription Coupled Nucleotide Excision Repair (TC-NER) sub-pathway, is responsible for gene expression accuracy by effectively removing DNA lesions that block the progression of elongating RNA Polymerase II (RNAPII) on the transcribed strand of active genes. The importance of this repair mechanism is illustrated by the severe symptoms of the rare progeroid disease Cockayne Syndrome, which is linked to defective TC-NER. Recent findings in our lab show that UV triggers a major transcription associated response that involves de novo synchronous release of elongation waves which maximize sensing and repair of DNA lesions throughout the transcribed genome (Lavigne et al., 2017). However, the chromatin changes associated with this widespread RNAPII release remain ambiguous. This data demonstrates that one such histone modification is the monoubiquitination of histone H2B on Lysine 120 (H2Bub), whose precise level is regulated by the synergistic action of RNF20/40 ubiquitin-ligase and the deubiquitinase (DUB) action of the DUB module of the SAGA (Spt-ADA-GCN5-Acetyltransferase) complex during transcription elongation. H2Bub is dynamically reduced in response to UV irradiation, and the regulation of this response is shown to be closely related with the transcription reorganisation that occurs concurrently. By analysing genome-wide distribution of H2Bub in ATXN7L3-DUB knockdown cells in the context of UV irradiation as well as transcription inhibition, it is shown that H2Bub patterns are dependent on gene features such as intron-exon architecture in both steady-state and irradiated conditions, and it is revealed that the global H2Bub loss observed is in fact a redistribution that closely mirrors the dynamics of RNAPII. The observed effects are due to a direct inter-dependence of H2Bub on RNAPII local concentration and speed whereas deficient ATXN7L3-mediated DUB activity leads to increased elongation rates (ER) in both non-irradiated and irradiated conditions. This data reveal that the H2Bub pattern follows that of RNAPII in response to UV guaranteeing faithful elongation speed in the context of the transcription-driven DNA damage response.

Ο μηχανισμός εκτομής νουκλεοτιδίων (NER), και ιδιαίτερα το υπομονοπάτι που συνδέεται με τη μεταγραφή (TC-NER), είναι υπεύθυνο για την επιδιόρθωση βλαβών του DNA που εμποδίζουν την πρόοδο της RNA πολυμεράσης ΙΙ (RNAPII) επιμήκυνσης στη μεταγραφόμενη αλυσίδα των ενεργών γονιδίων, εξασφαλίζοντας με τον τρόπο αυτόν την πιστή μεταγραφή. Η σημασία αυτού του μηχανισμού επιδιόρθωσης αποδεικνύεται από τα σοβαρά συμπτώματα της σπάνιας προγεροειδούς νόσου Σύνδρομο Cockayne, που συνδέεται με ελαττωματικό TC-NER. Πρόσφατα ευρήματα στο εργαστήριό μας δείχνουν ότι η υπεριώδης ακτινοβολία προκαλεί μια σημαντική μεταγραφική απόκριση που συμπεριλαμβάνει μια de novo συγχρονισμένη απελευθέρωση κυμάτων επιμήκυνσης, ενισχύοντας την ανίχνευση και την επιδιόρθωση των βλαβών του DNA σε ολόκληρο το μεταγραφόμενο γονιδίωμα (Lavigne et al., 2017). Ωστόσο, οι αλλαγές στο επίπεδο της χρωματίνης που καθορίζουν ή που προκαλούνται από αυτήν την εκτενή απελευθέρωση RNAPII παραμένουν ασαφείς.Τα δεδομένα της παρούσας διατριβής δείχνουν ότι μια ιστονική τροποποίηση που ενδεχομένως να έχει ρόλο στον μηχανισμό αυτόν είναι η μονο-ουβικουιτινίωση της ιστόνης H2B στην λυσίνη 120 (H2Bub), η οποία ρυθμίζεται από την συνεργατική δράση της ουμπικουτινάσης RNF20/40 και της δράσης από-ουβικουιτινίωσης (DUB) της υπομονάδας DUB του συμπλέγματος SAGA (Spt-ADA-GCN5-Acetyltransferase) κατά τη μεταγραφική επιμήκυνση. Το H2Bub μειώνεται δυναμικά ως απάντηση στην υπεριώδη ακτινοβολία, και η ρύθμιση αυτής της απόκρισης δείχνεται ότι σχετίζεται στενά με τη μεταγραφική αναδιάρθρωση που πραγματοποιείται ταυτόχρονα. Με ανάλυση της κατανομής της H2Bub σε κύτταρα με ανενεργή ATXN7L3 DUB σε συνθήκες έκθεσης σε υπεριώδη ακτινοβολία και αναστολής της μεταγραφής, δείχνεται ότι η κατανομή της H2Bub εξαρτάται από χαρακτηριστικά των γονιδίων, όπως η δομή των ιντρονίων και των εξονίων, και αποκαλύπτεται ότι η ολική μείωση της H2Bub που παρατηρείται, πρόκειται στην πραγματικότητα για μια αναδιανομή η οποία αντανακλά τη δυναμική της RNAPII. Τα παρατηρούμενα αποτελέσματα οφείλονται σε μια άμεση αλληλεξάρτηση του H2Bub στα επίπεδα και την ταχύτητα της RNAPII τοπικά, ενώ η μειωμένη δραστηριότητα της DUB ATXN7L3 οδηγεί σε αυξημένη ταχύτητα επιμήκυνσης υπο κανονικές συνθήκες και συνθήκες ακτινοβόλησης. Αυτά τα δεδομένα αποκαλύπτουν ότι η εικόνα της κατανομής του H2Bub ακολουθεί εκείνη της RNAPII, εξασφαλίζοντας την πιστή ταχύτητα επιμήκυνσης στο πλαίσιο της απόκρισης σε βλάβη του DNA (DNA damage response) που οδηγείται από τη μεταγραφή.