In vivo μελέτη για την εκτίμηση της επίδρασης ενδοκρινικών διαταρακτών σε κουνέλια έπειτα απο συνδυαστική και χρόνια έκθεση

Abstract

The advancement and evolution of industry have been closely associated with widespread pollution and the presence of various chemicals in both the environment and the food chain. Several surveys have indicated that numerous chemicals possess the capability to disrupt the endocrine system, and these substances are referred to as endocrine disruptors (EDCs). There is an increasing body of evidence highlighting their adverse effects on living organisms, which come into contact with EDCs primarily through the consumption of contaminated food and fluids, inhalation or absorption through the skin. Studies on human biomonitoring have revealed that the general population, including children, is seldom exposed to a solitary compound. Instead, exposure predominantly occurs to chemical combinations found in the environment (water, air, soil), as well as in food or consumer products. Currently, there is limited data regarding potential adverse effects both in humans and animals. The aim of this PhD thesis was to simulate human exposure to endocrine disruptors in real life. Specifically, we focused on assessing the synergistic or non-synergistic effects of glyphosate, BPA, PBs, TCS and DEHP, on the rabbit organism after a 12-month combined exposure to these compounds. In addition, a comparison was made of the effects following 12 months exposure to the pure form of glyphosate versus its commercial form (Roundup® herbicide). The toxicity of the above was assessed by examining redox biomarkers and biological markers of DNA damage (micronuclei count and comet intensity), and also by measuring reproductive hormones and estimating cytological damage. Throughout the in vivo experiment, results from different samplings showed an increase in micronuclei formation in a dose – and time – dependent manner. The same trend was also observed for tail intensity, but this was exclusively dose – related, given the limited number of samples (specifically, only the latter). The group receiving a high dose of a mixture of substances (HD group) seemed to be more affected in terms of tail intensity, probably due to the synergistic effect of the administered substances. In all exposure groups, there was a positive correlation between the number of micronuclei and tail intensity. Administration of the EDCs mixture induced perturbations of blood redox homeostasis at 3 months, while at 6 and 12 months it triggered redox adaptations. In contrast, exposure to GLY and Roundup®, individually, mainly induced perturbations of blood redox balance. At the tissue level, especially in the liver, administration of both EDCs mixture and Roundup® induced oxidative stress, whereas GLY did not. Furthermore, the administration of both EDCs and Roundup® caused detrimental effects on the redox status of the liver, a critical tissue with a valuable biological role in the detoxification of organisms from xenobiotics. According to the results of the measurement of reproductive hormone levels, the female rabbits did not show any particular differences, except for the case of T4 where both female and male rabbits showed an increase from 3 months onwards in the HD and Roundup groups. Β-estradiol remained almost unaffected throughout the experiment with no differences between males and females. Regarding testosterone levels in male rabbits, they increased after 3 months of exposure and decreased sharply at 12 months of exposure in the Glyphosate, HD and Roundup groups. T3 concentration increased at 3 months of exposure onwards and decreased at 12 months of exposure in the Roundup group. In parallel, progesterone levels decreased at 12 months of exposure (compared to 0 months) in the LD, HD and Roundup groups, while they increased in the Glyphosate group. The cytological findings make clear the existence of extensive lesions in the HD, Glyphosate and Roundup groups. Existence of ectasia, degeneration and carcinogenesis were recorded in liver, kidney, testis, ovary and thyroid gland, while the heart did not show any cytological lesions. Our findings indicate that exposure to EDCs, individually and in combination, causes adverse effects on the cytological scale, the DNA, the hormone levels and the redox status of the organism. This underlines the potential risks associated with daily exposure to these substances and highlights the urgent need for additional research in this area.

Η πρόοδος και η εξέλιξη της βιομηχανίας έχουν συνδεθεί στενά με την εκτεταμένη ρύπανση και την παρουσία διαφόρων χημικών ουσιών τόσο στο περιβάλλον όσο και στην τροφική αλυσίδα. Αρκετές έρευνες έχουν δείξει ότι πολυάριθμες χημικές ουσίες έχουν την ικανότητα να διαταράσσουν το ενδοκρινικό σύστημα και οι ουσίες αυτές αναφέρονται ως ενδοκρινικοί διαταράκτες (Ε.Δ.). Υπάρχει ένας αυξανόμενος όγκος στοιχείων που αναδεικνύει τις δυσμενείς επιπτώσεις τους στους ζωντανούς οργανισμούς, οι οποίοι έρχονται σε επαφή με τους ΕΔ κυρίως μέσω της κατανάλωσης επιβαρυμένων τροφίμων και υγρών, της εισπνοής ή της απορρόφησης μέσω του δέρματος. Μελέτες για τη βιοπαρακολούθηση του ανθρώπου έχουν αποκαλύψει ότι ο γενικός πληθυσμός, συμπεριλαμβανομένων των παιδιών, σπάνια εκτίθεται σε μια μεμονωμένη ένωση. Αντίθετα, η έκθεση γίνεται κυρίως σε χημικούς συνδυασμούς που βρίσκονται στο περιβάλλον (νερό, αέρας, έδαφος), καθώς και σε τρόφιμα ή καταναλωτικά προϊόντα. Προς το παρόν, υπάρχουν περιορισμένα δεδομένα σχετικά με τις πιθανές δυσμενείς επιδράσεις που προκύπτουν από την παρατεταμένη έκθεση σε χημικά μείγματα τόσο στον άνθρωπο όσο και στα ζώα. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η προσομοίωσης της έκθεσης του ανθρώπου σε ενδοκρινικούς διαταράκτες στην πραγματική ζωή. Συγκεκριμένα, επικεντρωθήκαμε στην εκτίμηση της συνδυαστικής δράσης των glyphosate (GLY), bisphenol A (BPA), parabens (PBs), triclosan (TCS) και di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP), στον οργανισμό κουνελιών έπειτα από δωδεκάμηνη συνδυαστική έκθεση σε αυτές τις ενώσεις. Παράλληλα, έγινε σύγκριση των επιπτώσεων που επήλθαν ύστερα από δωδεκάμηνη έκθεση στην καθαρή μορφή του glyphosate σε σχέση με την εμπορική του μορφή (ζιζανιοκτόνο Roundup®). Η εκτίμηση της τοξικότητας των ανωτέρω πραγματοποιήθηκε εξετάζοντας οξειδοαναγωγικούς βιοδείκτες και βιολογικούς δείκτες βλάβης του DNA (μέτρηση μικροπυρήνων και ένταση ουράς (comet)), και ακόμη μετρώντας τις αναπαραγωγικές ορμόνες και μελετώντας τις κυτταρολογικές βλάβες. Καθ' όλη τη διάρκεια του in vivo πειράματος, τα αποτελέσματα από διάφορες δειγματοληψίες έδειξαν αύξηση του σχηματισμού μικροπυρήνων με δοσο – και χρονο – εξαρτώμενο τρόπο. Η ίδια τάση παρατηρήθηκε και για την ένταση της ουράς, αλλά αυτή σχετιζόταν αποκλειστικά με τη δόση, δεδομένου του περιορισμένου αριθμού δειγματοληψιών (συγκεκριμένα, μόνο της τελευταίας). Η ομάδα που έλαβε υψηλή δόση μείγματος ουσιών (ομάδα HD) φάνηκε να επηρεάζεται περισσότερο όσον αφορά στην ένταση της ουράς, πιθανότατα λόγω της αθροιστικής επίδρασης των χορηγούμενων ουσιών. Σε όλες τις ομάδες έκθεσης, υπήρξε θετική συσχέτιση μεταξύ του αριθμού των μικροπυρήνων και της έντασης της ουράς. Η χορήγηση του μείγματος Ε.Δ. προκάλεσε διαταραχές της ομοιόστασης οξειδοαναγωγής του αίματος στους 3 μήνες, ενώ στους 6 και 12 μήνες ενεργοποίησε προσαρμογές οξειδοαναγωγής. Αντίθετα, η έκθεση σε GLY και Roundup®, μεμονωμένα, προκάλεσε κυρίως διαταραχές της οξειδοαναγωγικής ισορροπίας του αίματος. Σε επίπεδο ιστών, ιδίως στο ήπαρ, η χορήγηση τόσο του μείγματος Ε.Δ. όσο και του Roundup® προκάλεσε οξειδωτικό στρες, ενώ η GLY δεν το επηρέασε. Ακόμη, η χορήγηση του μείγματος Ε.Δ. και του Roundup®, προκάλεσε επιζήμιες επιδράσεις στην οξειδοαναγωγική κατάσταση του ήπατος, ενός κρίσιμου ιστού με πολύτιμο βιολογικό ρόλο στην αποτοξίνωση των οργανισμών από ξενοβιοτικά. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μέτρησης των επιπέδων των αναπαραγωγικών ορμονών, τα θηλυκά κουνέλια δεν παρουσίασαν ιδιαίτερες διαφοροποιήσεις, εκτός από την περίπτωση της Τ4 όπου τόσο στα θηλυκά όσο και στα αρσενικά κουνέλια παρουσιάστηκε αύξηση από τους 3 μήνες και μετά, στις ομάδες HD και Roundup. Η β-οιστραδιόλη παρέμεινε σχεδόν ανεπηρέαστη σε όλη τη διάρκεια του πειράματος χωρίς να παρουσιάζει διαφορές μεταξύ αρσενικών και θηλυκών. Όσον αφορά στα επίπεδα τεστοστερόνης στα αρσενικά κουνέλια αυξήθηκαν μετά τους 3 μήνες έκθεσης και μειώθηκαν κατακόρυφα στους 12 μήνες έκθεσης στις ομάδες Glyphosate, HD και Roundup. Η συγκέντρωση της Τ3 αυξήθηκε στους 3 μήνες έκθεσης, και μετά, σε όλες τις ομάδες ενώ μειώθηκε στους 12 μήνες στην ομάδα Roundup. Παράλληλα, τα επίπεδα της προγεστερόνης μειώθηκαν στους 12 μήνες έκθεσης (σε σχέση με τους 0 μήνες) στις ομάδες LD, HD και Roundup, ενώ αυξήθηκαν στην ομάδα Glyphosate.Τα κυτταρολογικά ευρήματα κάνουν σαφή την ύπαρξη εκτεταμένων βλαβών στις ομάδες HD, Glyphosate και Roundup. Ύπαρξη εκμαγείων, εκφυλισμός και καρκινογένεση καταγράφηκαν σε ήπαρ, νεφρούς, όρχεις, ωοθήκες και θυρεοειδή αδένα, ενώ η καρδιά δεν παρουσίασε κυτταρολογικές αλλοιώσεις. Τα ευρήματά μας αναδεικνύουν ότι η έκθεση σε Ε.Δ., μεμονωμένα αλλά και συνδυαστικά, προκαλεί δυσμενείς επιδράσεις σε κυτταρολογικό επίπεδο, στο DNA, στα επίπεδα των ορμονών και στην οξειδοαναγωγική κατάσταση του οργανισμού. Αυτό υπογραμμίζει τους πιθανούς κινδύνους που συνδέονται με την καθημερινή έκθεση σε αυτές τις ουσίες και υπογραμμίζει την επιτακτική ανάγκη για πρόσθετη έρευνα σε αυτόν τον τομέα.