Μεταβολομική και λιπιδομική ανάλυση στη μελέτη καρδιαγγειακών και μεταβολικών παθήσεων σε ασθενείς και μοντέλο ζωών

Abstract

The field of metabolomic and lipidomic analysis is identified as highly promising in research, providing essential insights into the roles of low molecular weight metabolites and lipids in the metabolic disorders linked to cardiovascular and metabolic diseases. In the first chapter of this dissertation, the lipid profiles of patients were investigated, based on the presence or absence of obstructive coronary artery disease (CAD). Blood serum samples were analyzed using LC–MS Orbitrap instrument and 517 lipids species were identified. Univariate and multivariate statistical analysis revealed a distinction between serum lipids of patients with and without obstructive CAD. Levels of glycerophospholipids, sphingolipids, and glycerolipids were significantly higher in patients with obstructive CAD. Finally, the XGBoost machine learning algorithm identified a panel of 17 biomarkers in serum capable of predicting obstructive CAD. In the second chapter, a detailed investigation was conducted to study the changes in the lipid profiles of liver and adipose tissue in NAFLD mice model induced by a high-fat diet in combination with 5% high corn fructose syrup (HCFS) in-take. The aim was to explore the changes caused by exercise and weight loss in the liver and adipose tissue lipids using untargeted UHPLC-TOF-MSMS lipidomic analysis. Several lipid classes contributed to the distinction between groups using multivariate statistical analysis models, such as glycerolipids, glycerophospholipids, sphingolipids, and fatty acids regarding liver samples, while triglycerides were found to be dysregulated in adipose tissue. These lipids were associated with established pathways involved in the biosynthesis of PCs and PEs, and TGs metabolism. In the last chapter, a comprehensive study of patient profiles with NAFLD and healthy controls was performed on plasma, liver biopsies, and urine samples. Analyses of the samples were conducted using targeted HILIC-MSMS, RPLC-MSMS, and GC-MS methods, as well as untargeted UHPLC-TOF-MSMS lipidomic analysis. The data were used to develop an algorithm, which identified a set of 15 biomarkers in blood plasma that could predict the progression of non-alcoholic steatohepatitis. The study of liver biopsy samples revealed differences in types of triglycerides and fatty acids. Finally, a rapid, simple, and reliable method was developed for the quantitative determination of 48 organic acids in urine of patients with NAFLD and healthy controls. The method was optimized for GC-MSMS conditions, extraction and derivatization protocols and was validated based on current guidelines for bioanalytical methods.

Η μεταβολομική και η λιπιδομική ανάλυση συμβάλλουν καθοριστικά στην κατανόηση του ρόλου που διαδραματίζουν συγκεκριμένοι μεταβολίτες μικρού μοριακού βάρους και λιπίδια στις μεταβολικές διαταραχές που σχετίζονται με τις καρδιαγγειακές και μεταβολικές παθήσεις. Στο πρώτο κεφάλαιο αυτής της διατριβής, διερευνήθηκαν τα προφίλ των λιπιδίων των ασθενών με βάση την ύπαρξη ή όχι της αποφρακτικής στεφανιαίας νόσου (ΣΝ). Τα δείγματα του ορού αίματος αναλύθηκαν με την τεχνική LC–MS Orbitrap από όπου ταυτοποιήθηκαν 517 είδη λιπιδίων. Με τη μονοπαραμετρική και πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση ανεδείχθη η διάκριση μεταξύ των ασθενών με αποφρακτική και χωρίς αποφρακτική ΣΝ. Πιο συγκεκριμένα, τα επίπεδα των γλυκεροφωσφολιπιδίων, σφιγγολιπιδίων και γλυκερολιπιδίων ήταν σημαντικά διαφοροποιημένα στους ασθενείς με αποφρακτική ΣΝ. Τέλος, ο αλγόριθμος Μηχανικής Μάθησης XGBoost εντόπισε ένα πάνελ 17 βιοδεικτών στον ορό αίματος ικανό να προβλέψει την αποφρακτική ΣΝ. Στο δεύτερο κεφάλαιο της διατριβής, πραγματοποιήθηκε η λεπτομερής διερεύνηση των αλλαγών στο προφίλ λιπιδίων του ήπατος και του λιπώδους ιστού σε μοντέλο μυών Μη Αλκοολικής Λιπώδους Νόσου του Ήπατος (ΜΑΛΝΗ) που επάγεται έπειτα από δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά με ταυτόχρονη χορήγηση 5% High Corn Fructose Syrup. Στόχος ήταν να διερευνηθούν οι αλλαγές που προκαλούνται από την άσκηση και την απώλεια βάρους στα λιπίδια του ήπατος και του λιπώδους ιστού των μυών με τη μη στοχευμένη UΗPLC-TOF-MSMS λιπιδομική ανάλυση. Αρκετές κατηγορίες λιπιδίων συνέβαλαν στη διάκριση των ομάδων όπως τα γλυκερολιπίδια, τα γλυκεροφωσφολιπίδια, τα σφιγγολιπίδια και τα λιπαρά οξέα όσον αφορά τα δείγματα ήπατος, ενώ τα τριγλυκερίδια ήταν η μοναδική κατηγορία λιπιδίων που βρέθηκε διαταραγμένη στον λιπώδη ιστό. Τα λιπίδια που βρέθηκαν απορυθμισμένα σχετίζονται με καθιερωμένες μεταβολικές οδούς που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση των PCs και PEs και στο μεταβολισμό των TGs. Στο τελευταίο κεφάλαιο της διατριβής πραγματοποιήθηκε μια ολοκληρωμένη μελέτη του μεταβολικού προφίλ των ασθενών με ΜΑΛΝΗ και των υγιών μαρτύρων στα δείγματα πλάσματος, βιοψίας ήπατος και ούρων. Οι αναλύσεις των δειγμάτων πραγματοποιήθηκαν με στοχευμένες HILIC-MSMS, RPLC-MSMS και GC-MS μεθόδους όπως επίσης και με τη μη στοχευμένη UΗPLC-TOF-MSMS λιπιδομική ανάλυση. Τα δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη ενός προγνωστικού αλγορίθμου, ο οποίος εντόπισε ένα σύνολο 15 βιοδεικτών στο πλάσμα αίματος που μπορούν να προβλέψουν την εξέλιξη της μη αλκοολικής στεατοηπατίτιδας. Η μελέτη των δειγμάτων της βιοψίας του ήπατος παρουσίασε διαφοροποιήσεις μεταξύ ειδών τριγλυκεριδίων και λιπαρών οξέων. Τέλος, αναπτύχθηκε μια γρήγορη απλή και αξιόπιστη μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό 48 οργανικών οξέων στα ούρα των ασθενών με ΜΑΛΝΗ και των υγιών μαρτύρων. Η μέθοδος βελτιστοποιήθηκε όσον αφορά τις συνθήκες ανάλυσης στην οργανολογία GC-MSMS, τις μεθόδους εκχύλισης και παραγωγοποίησης των οργανικών οξέων, ενώ επικυρώθηκε με βάση τις τρέχουσες οδηγίες για βιοαναλυτικές μεθόδους.