Χαρακτηρισμός μικροφυκών από ποικίλα ενδιαιτήματα και διερεύνηση της μεταβολικής ποικιλότητας τους

Abstract

Phytoplankton consists of photosynthetic prokaryotic and eukaryotic microorganisms undergoing passive translocation by water movement. Phytoplanctic organisms are considered the most important primary producers of aquatic ecosystems, responsible to produce at least half of the oxygen found in the atmosphere, also contributing to the carbon’s global cycle by removing vast quantities through its fixation. In addition, the sedimentation of the dead phytoplanctic biomass over millions of years in oceans and inland waters has produced most of the fossil fuels on Earth. Phytoplankton supports the food chain in aquatic ecosystem communities. Thus, any change that occurs in its bio communities affects the balance of the entire ecosystem. Some algal species are used as food, in research as model organism, in industrial and pharmaceutical products etc. Scientific interest has turned to the potential of phytoplankton to produce valuable products. Compounds with antibiotic, anticancer, etc. action, lipids, or carbohydrates to produce biofuels, proteins and lipids for animal and/or human nutrition as well as pigments are phytoplanctic products of great interest. Apart from the many positive properties of these organisms, unpleasant conditions are created under certain environmental conditions, in which some phytoplankton species grow rapidly to achieve high population density and produce dangerous toxins that can harm fish, birds and humans. Therefore, there is a need to study these organisms and their properties. This PhD thesis was designed to study the diversity of Chlorophyta (one of the largest groups of photosynthetic eukaryotic algae) strains isolated from diverse habitats of Greece using molecular and morphological characters. Molecular markers (18S rRNA gene, ITS region, rbcL gene) were used in the phylogeny of the strains, in combination with morphological descriptions and evaluation of their subcellular structure. A total of 24 strains were characterized and new microalgae diversity was revealed. Thus, four new genera and five new species belonging to the classes Chlorophyceae and Trebouxiophyceae were described. The production of valuable cellular metabolic products of 30 photosynthetic micro eukaryotic strains belonging to the phyla Chlorophyta, Heterokontophyta, Cercozoa and Bacillariophyta was studied during the second part of the thesis. Specifically, the percentage of their cellular content in lipids, carbohydrates and proteins was measured with analytical methods, while the amount of the pigments chlorophyll a (Chl α), chlorophyll b (Chl b) and total carotenoids (Car) were also measured after extraction in pure methanol. The results were encouraging as strains had over 75% of their total cellular content to be composed of the three bioactive compounds. Chl α was the predominant pigment in the majority of the extracts. Four strains, two of which were isolated from marine environments, were found to have cumulatively more than 20 μg/mL pigments. In addition, the potential of strains to produce bioactive compounds against pathogenic bacterial species was studied. In the antibacterial assays, extracts of eukaryotic strains were used, obtained by five different solvents. Positive results were obtained as well, since six of the strains inhibited the growth of three bacteria with extracts of different solvents. The aim of this part was to perform a first screening of all studied eukaryotic strains for their metabolic diversity and the potential to produce high added value metabolic products, in the default culture conditions. It is known that stressful conditions during the growth of microorganisms induce the production of valuable compounds. Therefore, strains that have been shown to have the ability to produce metabolic products with great utility are worthy of further investigation to enhance their potencies. The new species described in the thesis appear to be able to produce bioactive compounds and valuable metabolic products.

Το φυτοπλαγκτό αποτελείται από φωτοσυνθετικούς προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς μικροοργανισμούς που υπόκεινται σε παθητική μετακίνηση μέσα στο νερό και θεωρούνται από τους πιο σημαντικούς πρωτογενείς παραγωγούς των υδάτινων οικοσυστημάτων. Είναι υπεύθυνο για την παραγωγή τουλάχιστον της μισής ποσότητας οξυγόνου που βρίσκεται στην ατμόσφαιρα ενώ συνδράμει ουσιαστικά στον παγκόσμιο κύκλο του άνθρακα, απομακρύνοντας τεράστιες ποσότητες CO2 μέσω της διαδικασίας της καθήλωσής του. Επιπλέον, οι αποθέσεις της νεκρής οργανικής βιομάζας φυτοπλαγκτού, για εκατομμύρια χρόνια στους πυθμένες ωκεανών και εσωτερικών υδάτων, είναι υπεύθυνες για τα περισσότερα αποθέματα ορυκτών καυσίμων που βρίσκονται σήμερα στη Γη. Το φυτοπλαγκτό αποτελεί τη βάση της τροφικής αλυσίδας στις κοινότητες των υδάτινων οικοσυστημάτων, με αποτέλεσμα κάθε μεταβολή που συμβαίνει στις βιοκοινωνίες του να επηρεάζει την ισορροπία ολόκληρου του υδάτινου οικοσυστήματος.Είδη φυκών χρησιμοποιούνται στη διατροφή, στην ερεύνα ως οργανισμοί μοντέλα, σε βιομηχανικά προϊόντα, σε φαρμακευτικά σκευάσματα και αλλού. Το επιστημονικό ενδιαφέρον έχει στραφεί στις δυνατότητες που έχουν είδη του φυτοπλαγκτού για παραγωγή πολύτιμων προϊόντων μέσω του μεταβολισμού τους, όπως ενώσεις με αντιβιοτική, αντικαρκινική και άλλες δράσεις, λιπίδια ή υδρογονάνθρακες για παραγωγή «πράσινων» καυσίμων, πρωτεΐνες και λιπίδια για παραγωγή ζωοτροφών ή ακόμη και για ανθρώπινη κατανάλωση και απομόνωση διάφορων χρωστικών που χρησιμοποιούν κατά τη διαδικασία της φωτοσύνθεσης, είναι μόνο μερικά συστατικά που έχουν μεγάλο ενδιαφέρον για τον άνθρωπο και παράγονται από φυτοπλαγκτικούς οργανισμούς. Εκτός των πολλών θετικών ιδιοτήτων που έχουν αυτοί οι οργανισμοί, κάτω από ορισμένες περιβαλλοντικές συνθήκες αναπτύσσονται τάχιστα, σχηματίζοντας υψηλής πυκνότητας πληθυσμούς με δυσάρεστα αποτελέσματα και μερικοί εξ αυτών παράγουν επικίνδυνες τοξίνες που μπορούν να προσβάλουν ιχθύες, πτηνά και τον άνθρωπο. Τα παραπάνω αναδεικνύουν την ανάγκη μελέτης αυτών των οργανισμών και των ιδιοτήτων τους. Η παρούσα διδακτορική διατριβή σχεδιάστηκε έτσι ώστε να μελετηθεί η ποικιλότητα στελεχών χλωροφυκών (από τις μεγαλύτερες ομάδες φωτοσυνθετικών ευκαρυωτικών φυκών) που απομονώθηκαν από ποικίλα οικοσυστήματα της Ελλάδας με τη χρήση μοριακών και μορφολογικών χαρακτήρων. Ο χαρακτηρισμός της ποικιλότητας προσεγγίστηκε τόσο ταξινομικά όσο και μεταβολικά. Για την επίτευξη αυτού του σκοπού χρησιμοποιήθηκαν μοριακοί δείκτες (γονίδιο 18S rRNA, περιοχή ITS, γονίδιο rbcL) που χρησιμοποιούνται στη φυλογένεση τέτοιων οργανισμών, μορφολογικές περιγραφές και στοιχεία της υποκυτταρικής δομής τους. Αποτέλεσμα ήταν ο χαρακτηρισμός 24 στελεχών και η ανάδειξη νέας ποικιλότητας χλωροφυκών που φιλοξενούνται σε υδάτινα οικοσυστήματα της Ελλάδας. Περιγράφηκαν τέσσερα γένη και πέντε είδη νέα για την επιστήμη, που ανήκουν στις Κλάσεις Chlorophyceae και Trebouxiophyceae.Στο δεύτερο μέρος της διατριβής μελετήθηκε η παραγωγή πολύτιμων κυτταρικών προϊόντων, αποτέλεσμα του μεταβολισμού συνολικά 30 στελεχών φωτοσυνθετικών μικροευκαρυωτών που ανήκουν στα φύλα Χλωρόφυτα, Ετεροκοντόφυτα, Κερκόζωα και Βακιλλαριόφυτα. Συγκεκριμένα, μετρήθηκε με τη χρήση αναλυτικών μεθόδων το ποσοστό του κυτταρικού τους περιεχομένου σε λιπίδια, υδατάνθρακες και πρωτεΐνες, καθώς και η ποσότητα χλωροφύλλης a (Chl α), χλωροφύλλης b (Chl b) και ολικών καροτενοειδών (Car) μέσω της εκχύλισης τους με απόλυτη μεθανόλη. Προέκυψαν ενθαρρυντικά αποτελέσματα, με κάποια στελέχη να περιέχουν σε ποσοστό περισσότερο από το 75% του συνολικού κυτταρικού τους περιεχομένου, τις τρεις βιοδραστικές ενώσεις. Επίσης, η Chl α αναδείχθηκε ως η κυρίαρχη χρωστική στην πλειονότητα των εκχυλισμάτων, ενώ τέσσερα στελέχη, δύο εκ των οποίων θαλάσσια, βρέθηκε να περιέχουν χρωστικές αθροιστικά πάνω από 20 μg/mL.Επιπλέον, μελετήθηκε η δυνατότητα παραγωγής βιοδραστικών ενώσεων από τα μελετώμενα στελέχη, έναντι παθογόνων βακτηριακών ειδών. Στις αντιβακτηριακές δοκιμές χρησιμοποιηθήκαν εκχυλίσματα που προέκυψαν από την εκχύλιση του κυτταρικού περιεχομένου ευκαρυωτικών φωτοσυνθετικών μικροοργανισμών σε έξι διαφορετικούς διαλύτες, με θετικά αποτελέσματα, αφού έξι στελέχη ανέστειλαν την ανάπτυξη τριών βακτηρίων με εκχυλίσματα διαφορετικών διαλυτών. Ο στόχος αυτής της ενότητας ήταν να πραγματοποιηθεί ένας πρώτος έλεγχος όλων των μελετώμενων ευκαρυωτικών στελεχών, αναφορικά με τη μεταβολική ποικιλότητας τους και τη δυνατότητα παραγωγής προϊόντων μεταβολισμού υψηλής προστιθέμενης αξίας, στις προκαθορισμένες συνθήκες καλλιέργειας. Είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι στρεσογόνες συνθήκες κατά τη διάρκεια ανάπτυξης των μικροοργανισμών επάγουν την παραγωγή πολύτιμων ενώσεων. Συνεπώς, με αυτή τη μελέτη έγινε το πρώτο βήμα για να μελετηθούν αργότερα, πιο στοχευμένα, στελέχη που έδειξαν ότι έχουν την ικανότητα παραγωγής μεταβολικών προϊόντων με μεγάλη χρησιμότητα. Νέα είδη που χαρακτηρίστηκαν στο πλαίσιο αυτής της διατριβής φαίνεται να είναι σε θέση να παράγουν βιοδραστικές ενώσεις και πολύτιμα μεταβολικά προϊόντα.