Study on microplastic particles ingestion and the occurrence of related chemical additives in commercial fish species across different habitats of North Aegean Sea

Abstract

Over the last few decades, the increasingly vast production and use of plastics, which reflects the challenging shift from multiple-use to single-use plastics, and the improper disposal of plastic waste that led to their widespread presence in the environment, have raised concerns regarding their potential impact on the marine ecosystem. Microplastics (MPs), defined as plastics smaller than 5 mm, have been identified in various compartments of marine ecosystems, including coastal and pelagic habitats, oceanic gyres, and even the deepest parts of the ocean. The small size of MPs makes them available to a wide range of organisms in the marine food webs, and their ingestion has been extensively documented by the scientific community. It has been hypothesized that the characteristics of MPs, such as their size and color, may have a positive effect on the likelihood of ingestion that derives from MPs resembling their prey. Once ingested, MPs can have physical, biological, and chemical impacts as they are able to cause injuries and prompt alterations in the specimen's condition. In addition to MPs, chemical additives that are added to plastics during the manufacturing process to improve their properties, can also have adverse effects on marine organisms. As they are not chemically bound to plastic, they can easily leach out and accumulate in marine organisms. Phthalates (PAEs) and bisphenols, particularly bisphenol A, are chemical additives that have been identified as endocrine disruptors due to their ability to interfere with the endocrine functions of marine organisms, but also of humans. Through the systematic review guidelines and protocols, as outlined in the Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA) (Chapter 2), the ingestion of MPs by marine organisms has been retrieved globally across marine fauna covering a period from 1972 to 2021. Meta-analysis was conducted to estimate the mean MPs abundances within the commercial marine biota groups. Further, ingested MPs characteristics were collected (type, size, color, and material) and were quantitatively analyzed based on the most frequently found characteristic among the examined. More than 1043 marine species have been examined worldwide for MPs ingestion (Pisces (43.9%), Mollusca (21%), Crustacean (11%), Aves (5.6%), Echinodermata (4.1%), Mammalia (3.7%), Cnidaria (2.9%), Reptilia (2.7%), Polychaeta (2.4%), and Porifera, Tunicata, Ctenophora and Chaetognatha (less than 1% each group)) and was verified for at least 822 species. At least one MPs was ingested by 513 species of Pisces, with the mean abundance of the different Families ranging from 0.07 to 16.3 MPs/ind. In contrast to Pisces (Teleostei and Elasmobranchii) the gastrointestinal tract (GIT) was examined, and the whole soft tissue was usually analyzed for Gastropoda, Bivalvia, and Malacostraca (mean values of 8.85, 3.64, 1.03 MPs/ind.) and Echinodermata (1.56 MP/g), while different measurement units were also used. Notably, there was high heterogeneity among and within most Families. In total, MPs' most frequently found characteristics were fibers, measuring less than 1 mm, black in color, and composed of polyethylene (PE), while a wide range of qualitative descriptors were presented for color and various class sizes with no common class interval. On the local scale, MPs ingestion was investigated for the commercially important fish species Engraulis encrasicolus, Sardina pilchardus, Boops boops, and Mullus barbatus collected from the North Aegean Sea (Mytilene and Kavala fishmarkets) (Chapter 3). A preliminary study was conducted, based on the fishery landings data provided by the Hellenic Statistical Authority, to select the most appropriate species and sites and further investigate their biological characteristics that could have an effect on MPs ingestion (Chapter 1). In total 578 specimens were analyzed, the GITs were extracted, and wet digestion with 30% hydrogen peroxide (1:20 w/v) was performed at 60oC. The remaining matter was filtered on fiberglass filters and then each filter was examined under stereomicroscope. The characteristics of each plastic particle (a. type: fiber/filament, fragment, film, and pellet/sphere, b. color, and c. size: maximum length in mm) were recorded. A subgroup of the total MPs was selected for polymeric identification and Fourier Transform Infrared spectroscopy (FT-IR) was applied. In total 567 plastic items were found including both 551 MPs ( < 5 mm) and 16 mesoplastics (MSPs, between 5 up to 16.8 mm). MSPs were ranging from 0 to 7% of the total found items per species and fibers transparent in color sizing 7-8 mm were the most frequently found MSPs. Examining only MPs ingestion, the frequency of occurrence (FO) was 47.8% and the mean abundance was 0.95 ± 0.17 (SE, Standard Error). The highest MPs mean abundance was recorded in S. pilchardus and was 1.6 ± 0.2 (SE) MPs/ind, while the FO was 63.9% of the total examined specimen. M. barbatus had the lowest FO at both sites (Mytilene and Kavala 36.6 and 36.3% respectively). No correlation was found between the size of the total examined specimen and the abundance of MPs. Previously published results of mean MPs abundances and FO for the four species in the Mediterranean basin were organized on maps of the General Fisheries Commission for the Mediterranean General Subareas, revealing that the findings of this study were in line with the range of previous findings. Overall, the most abundant MPs were fibers, blue, within 0.1- 0.33 mm and made of Polyethylene. The frequency distribution of the type and color were statistically significantly different between the sites (Mytilene and Kavala), while type, color, and size were statistically significantly different between the species. The overall total abundance of MPs between the two sites, was statistically significant different (p < 0.05, Kruskal-Wallis test). The size of the fish and the Fulton’s condition factor K did not affect MPs abundances. The habitat and the feeding preference of M. barbatus (benthivore and omnivore with a preference for animals) had an effect on MPs abundance. Further, the predatory feeding on macrofauna and the selective plankton feeding were also examined, and strong significant differences in MPs abundances were reported between the two feeding habits. Previous findings suggested that the size and condition of the specimen could affect the incident of MPs ingestion, while in other cases there was no effect. Estimates of the dietary intake of MPs in humans, based on the MPs content of E. encrasicolus and S. pilchardus that can be consumed as a whole, were at the lower end of the ranges previously reported in the literature. The presence of Phthalic acid esters (PAEs) and Bisphenol A (BPA) were investigated in GIT and muscle tissue of E. encrasicolus, S. pilchardus, B. boops, and M. barbatus from the North Aegean (Chapter 4). Further, a comparison study was conducted between two important divisions of fisheries (the North Aegean and the Western Ionian Seas, thereof NAS and IOS respectively) of the Mediterranean Sea. DEHP (bis(2-ethylhexyl) phthalate) had the highest mean concentrations of the examined PAEs for all four species. Statistically significant differences in DEHP mean concentrations were observed between the tissues of B. boops (NAS) and S. pilchardus (IOS) (p < 0.05, Wilcoxon rank test). DIDP (diisodecylphthalate) was the following mostly found PAE, although no statistically significant differences were presented between sites, species, and tissues. DINP (di-isononylphthalate) was recorded only in the GIT of E. encrasicolus (NAS), while the rest of the examined PAEs were present in a part of the samples. BPA was detected in all species from NAS, and E. encrasicolus, B. boops, and M. barbatus from IOS. Overall the mean concentrations detected in the muscle of species were at the lower end of previously found concentrations and the Daily Intake and the Target Hazard Quotient (THQ) indicated that PAEs and BPA had a low likelihood to prompt effect in children and adults for both fisheries divisions due to consumption of contaminated fish. Monitoring the ingestion of microplastics (MPs) by fish in different habitats, along with their associated plastic additives, is crucial for evaluating their impact on marine organisms, and also important to consider the potential effects on human health from consuming contaminated fish. The research effort of the current Ph.D. thesis aimed to update the knowledge about MPs ingestion and to provide new information regarding MPs and related additives of commercial fish species of the North Aegean Sea. It was evidence that the implementation of harmonized protocols could reduce the heterogeneity among the findings intended for meta-analysis and comparisons, but also more effectively address the MPs issue. The latter was also verified by the lack of a common reporting framework (i.e. measurement units, qualitative descriptors, constant size classes). The four selected species have been proposed as suitable bioindicators for small-scale MPs pollution monitoring in the Mediterranean Sea, thus further investigation is needed to identify potential under- or overestimation of MPs abundances and chemical additives produced by species-related characteristics. Further, an investigation of the relationship between MPs and chemical additives detected in different tissues considering the different metabolic pathways is needed (Chapter 5). Applying approaches that include the monitoring of more than one species within the same habitat may highlight the origin of MPs abundance variations. Further research is also needed to provide methodological approaches to determine the cumulative exposure risk of MPs and chemical additives.

Τις τελευταίες δεκαετίες, η ραγδαία αύξηση της παραγωγής και της χρήσης των πλαστικών που αντικατοπτρίζεται στην στροφή από τα πλαστικά πολλαπλών χρήσεων στα πλαστικά μιας χρήσης, και η μη ενδεδειγμένη διαχείριση των πλαστικών απορριμμάτων οδήγησε στην ευρεία παρουσία τους στο περιβάλλον, η οποία προκαλεί ανησυχίες σχετικά με τις πιθανές επιπτώσεις τους στα θαλάσσια οικοσυστήματα. Τα μικροπλαστικά (πλαστικά σωματίδια μικρότερα των 5 mm στη μεγαλύτερή τους διάσταση) έχουν εντοπιστεί σε διάφορα επιμέρους τμήματα των θαλάσσιων οικοσυστημάτων, συμπεριλαμβανομένων των παράκτιων και πελαγικών ενδιαιτημάτων, των μεγάλων ωκεάνιων δομών κυκλοφορίας, ακόμη και στα βαθύτερα σημεία του ωκεανού. Το μικρό τους μέγεθος, καθιστά εύκολη την πρόσληψή τους από μεγάλο εύρος οργανισμών του θαλάσσιου τροφικού πλέγματος, και η κατάποσή τους έχει εκτενώς παρατηρηθεί από την επιστημονική κοινότητα. Τα χαρακτηριστικά τους, όπως το μέγεθος και το χρώμα, θεωρείται ότι επηρεάζουν την πιθανότητα κατάποσής τους από θαλάσσιους οργανισμούς, η οποία αυξάνεται όταν τα μικροπλαστικά προσομοιάζουν με την τροφή του οργανισμού. Μετά την κατάποσή τους δύναται να τραυματίσουν τους ιστούς ή να έχουν τοξική δράση στον οργανισμό με την πυροδότηση αλλαγών στις βιολογικές λειτουργίες του. Παράλληλα, τα χημικά πρόσθετα που χρησιμοποιούνται κατά την παραγωγή των πλαστικών, για τη βελτίωση των ιδιοτήτων τους μπορούν και αυτά να προκαλέσουν αρνητικές επιπτώσεις. Τα χημικά πρόσθετα, καθώς δε συγκρατούνται με χημικούς δεσμούς με τα πλαστικά πολυμερή, τείνουν να απελευθερώνονται εύκολα στους ιστούς των οργανισμών. Μεταξύ των χημικών πρόσθετων, οι φθαλικές ενώσεις και οι δισφαινόλες, ιδιαίτερα η δισφαινόλη Α (BPA) που είναι ευρέως χρησιμοποιούμενη, έχουν χαρακτηριστεί ως ενδοκρινικοί διαταράκτες εξαιτίας της σχετικής τους δράσης στους θαλάσσιους οργανισμούς, αλλά και στους ανθρώπους που εκτίθενται σε αυτούς. Η συστηματική βιβλιογραφική ανασκόπηση (Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses, PRISMA) (Chapter 2) εφαρμόστηκε για συλλογή δεδομένων που αφορούσαν την κατάποση μικροπλαστικών από τους θαλάσσιους οργανισμούς παγκοσμίως και για την χρονική περίοδο από το 1972 έως το 2021. Η μέση τιμή αφθονίας των μικροπλαστικών εκτιμήθηκε με τη μετα-ανάλυση των δεδομένων για τις ομάδες που περιείχαν εμπορικά είδη. Επιπλέον, συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν τα χαρακτηριστικά των μικροπλαστικών (τύπος, μέγεθος, χρώμα, και υλικό). Περισσότερα από 1043 θαλάσσια είδη έχουν εξεταστεί, Ιχθύες (43.9%), Μαλάκια (21%), Καρκινοειδή (11%), Πτηνά (5.6%), Εχινοδέρματα (4.1%), Θηλαστικά (3.7%), Κνιδόζωα (2.9%), Ερπετά (2.7%), Πολύχαιτοι (2.4%), Ποροφόρα, Χιτωνοφόρα, Κτενοφόρα και Χαιτόγναθα (< 1% των συνολικών ειδών). Η κατάποση επιβεβαιώθηκε σε τουλάχιστον 822 είδη, εκ των οποίων 513 ανήκαν στην ομάδα των Ιχθύων με μέση αφθονία ανά εξεταζόμενη Οικογένεια από 0,07 έως 16,3 μικροπλαστικά ανά άτομο. Σε αντίθεση με τους Ιχθύες όπου συνήθως αναλυόταν ο γαστρεντερικός σωλήνας, όλος ο μαλακός ιστός εξεταζόταν στα γαστερόποδα, τα δίθυρα, τα μαλακόστρακα (με μέση τιμή 8,85, 3,64 και 1,03 μικροπλαστικά/άτομο αντίστοιχα) και τα Εχινοδέρματα (1,56 μικροπλαστικά/γραμμάριο). Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι διαφορετικές μονάδες μέτρησης της αφθονίας χρησιμοποιούνταν μεταξύ των διαφορετικών οργανισμών. Οι μέσες αφθονίες των μικροπλαστικών εξετάστηκαν και στο επίπεδο της Οικογένειας και μεγάλη ετερογένεια παρουσιάστηκε στα αποτελέσματα. Από το σύνολο των μικροπλαστικών, τα πιο συχνά χαρακτηριστικά που παρατηρήθηκαν ήταν οι ίνες, μεγέθους μικρότερου του 1 χιλιοστού, μαύρου χρώματος και η πολυμερική τους σύσταση απαρτιζόταν από πολυαιθυλένιο. Μεγάλο εύρος μεταξύ των διαφορετικών περιγραφών των χαρακτηριστικών τους εντοπίστηκε για το χρώμα και το μέγεθος, καθώς για το τελευταίο εντοπίστηκε πλήθος διαφορετικών βημάτων που καθορίζουν την κλάση μεγέθους.Για την εξέταση της κατάποσης μικροπλαστικών συλλέχθηκαν τα εμπορικά είδη Engraulis encrasicolus, Sardina pilchardus, Boops boops, και Mullus barbatus από το Βόρειο Αιγαίο (Chapter 3). Για την επιλογή των ειδών διεξήχθη προκαταρκτική μελέτη που συμπεριελάμβανε την ανάλυση των εκφορτώσεων από τις επιμέρους περιοχές των Ελληνικών θαλασσών και τα πιθανά χαρακτηριστικά των ιχθύων που δύνανται να επηρεάζουν την κατάποση μικροπλαστικών (Chapter 1). Συνολικά, 578 άτομα των αναφερόμενων ειδών εξετάστηκαν με την απομόνωση και χώνευση του γαστρεντερικού σωλήνα με διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου 30% (1:20 w/v) στους 60 oC. Το υπολειπόμενο υλικό διηθήθηκε, και τα φίλτρα παρατηρήθηκαν σε στερεομικροσκόπιο ώστε να καταγραφεί: α. ο τύπος του μικροπλαστικού (ίνα, θραύσμα, φίλμ, πέλετ), β. το χρώμα, και γ. το μέγεθος. Σε ένα υποσύνολο των ευρημάτων, εφαρμόστηκε Φασματοφωτομετρία Υπερύθρου με Μετασχηματισμό Fourier (FT-IR) με σκοπό τον προσδιορισμό της πολυμερικής τους σύνθεσης. Συνολικά, εντοπίστηκαν 567 πλαστικά τεμάχια, 551 μικροπλαστικά (< 5 mm) και 16 μεσοπλαστικά (> 5 έως 16.8 mm). Τα μεσοπλαστικά αντιστοιχούσαν στο 0 έως 7% των συνολικών πλαστικών για κάθε είδος ψαριού. Τα πιο συχνά μεσοπλαστικά ήταν οι διάφανες ίνες, με μήκος μεταξύ 7 και 8 χιλιοστών. Λαμβάνοντας υπόψη μόνο την κατάποση μικροπλαστικών, η μέση συχνότητα κατάποσης ήταν 47.8% και η μέση αφθονία τους 0.95 ± 0.2 (SE). Η υψηλότερη μέση αφθονία εντοπίστηκε στο S. pilchardus και ήταν 1.6 ± 0.2 (SE) μικροπλαστικά/άτομο, ενώ στο ίδιο είδος εντοπίστηκε και η υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης (63.9%). Η χαμηλότερη μέση κατάποση και στις δύο εξεταζόμενες περιοχές δειγματοληψίας εντοπίστηκε στο M. barbatus (36.6 and 36.3%, Μυτιλήνη και Καβάλα αντίστοιχα), ενώ η αφθονία των μικροπλαστικών μεταξύ των δύο περιοχών ήταν στατιστικά σημαντική (p < 0.05, Kruskal-Wallis test). Όσον αφορά τα χαρακτηριστικά των μικροπλαστικών, τα πιο συχνά ευρήματα ήταν ίνες, μπλε, μεταξύ 0.1-0.33 χιλιοστών, κατασκευασμένες από πολυαιθυλένιο. Στατιστική σημαντικότητα εντοπίστηκε χωρικά, μεταξύ της κατανομής συχνοτήτων του τύπου και του χρώματος των μικροπλαστικών. Επιπλέον, στατιστική σημαντικότητα εντοπίστηκε μεταξύ των διαφορετικών ειδών ως προς την κατανομή συχνοτήτων του τύπου, του μεγέθους, του χρώματος των μικροπλαστικών. Το μέγεθος του εξεταζόμενου ατόμου και ο συντελεστής ευρωστίας (Fulton’s condition factor K) δεν είχαν επίδραση στην αφθονία των μικροπλαστικών. Τα ευρήματα είναι σε συμφωνία με προηγούμενες σχετικές μελέτες, αν και είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι ορισμένες από αυτές που έχουν προηγηθεί έχουν αναδείξει στατιστική σημαντικότητα μεταξύ του μεγέθους και του συντελεστή ευρωστίας με την αφθονία των μικροπλαστικών. Το ενδιαίτημα, η τροφική προτίμηση και ο μηχανισμός τροφοληψίας είχε στατιστικά σημαντική συσχέτιση με την αφθονία των μικροπλαστικών για το M. barbatus. Οι εκτιμήσεις της πρόσληψης των μικροπλαστικών από τον άνθρωπο μέσω της διατροφής του, που έγιναν με βάση την περιεκτικότητα σε μικροπλαστικά του E. encrasicolus και του S. pilchardus που μπορούν να καταναλωθούν στο σύνολό τους, διαπιστώθηκε ότι βρίσκονταν στο κατώτερο άκρο των τιμών που είχαν αναφερθεί προηγουμένως στη βιβλιογραφία.Οι φθαλικές ενώσεις και η δισφαινόλη Α, ως συνήθως χρησιμοποιούμενα χημικά πρόσθετα, επιλέχθηκαν για να εξεταστεί η παρουσία τους στον γαστρεντερικό σωλήνα και τη σάρκα των επιλεγμένων ψαριών που συλλέχθηκαν από τις δύο περιοχές του Β. Αιγαίου (Chapter 4). Παράλληλα, για τα τέσσερα επιλεγμένα είδη πραγματοποιήθηκε μία συγκριτική μελέτη για τη διερεύνηση χωρικών διαφορών μεταξύ των αλιευτικών πεδίων του Β. Αιγαίου και του Δ. Ιονίου πελάγους. Μεταξύ των φθαλικών ενώσεων, η DEHP (bis(2-ethylhexyl) phthalate) είχε τις υψηλότερες μέσες συγκεντρώσεις και για τα τέσσερα είδη ψαριών. Στατιστικά σημαντικές διαφορές στις μέσες συγκεντρώσεις της DEHP εντοπίστηκαν για το B. boops του Β. Αιγαίου and S. pilchardus του Δ. Ιονίου (p < 0.05, Wilcoxon rank test). Η DIDP (diisodecylphthalate) ήταν η αμέσως μετά πιο συχνά ανιχνευόμενη φθαλική ένωση, αν και στατιστική σημαντικότητα δεν εντοπίστηκε μεταξύ των τεσσάρων ειδών, των δύο περιοχών ή των δύο εξεταζόμενων ιστών. Η DINP (di-isononylphthalate) εντοπίστηκε μόνο στα δείγματα που αφορούσαν το γαστρεντερικό σωλήνα του E. encrasicolus που συλλέχθηκε από το Β. Αιγαίο, ενώ οι υπόλοιπες εξεταζόμενες φθαλικές (3/7) ενώσεις εντοπίστηκαν σε μικρότερο μέρος του συνόλου. Η δισφαινόλη Α ανιχνεύτηκε και στα τέσσερα είδη ψαριών από το Β. Αιγαίο και στα E. encrasicolus, B. boops, και M. barbatus του Δ. Ιονίου. Συνολικά οι μέσες συγκεντρώσεις των επιλεγμένων χημικών πρόσθετων ήταν στις χαμηλές τιμές του εύρους σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες και η εκτίμηση της ημερήσιας πρόσληψης και του κινδύνου μέσω της κατανάλωσης της σάρκας των ψαριών ανέδειξε ότι υπάρχει χαμηλή πιθανότητα έκθεσης σε κίνδυνο για τις φθαλικές ενώσεις και τη δισφαινόλη Α. Η παρακολούθηση της κατάποσης μικροπλαστικών από τα ψάρια διαφορετικών ενδιαιτημάτων και των σχετιζόμενων ρύπων θεωρείται απαραίτητη για την εκτίμηση των επιπτώσεων τους στους θαλάσσιους οργανισμούς, αλλά και στον άνθρωπο. Η ερευνητική προσπάθεια στο πλαίσιο αυτής της Διδακτορικής Διατριβής επικεντρώθηκε στην επικαιροποίηση της γνώσης σχετικά με την κατάποση μικροπλαστικών και στη διεύρυνση επιστημονικής πληροφορίας που αφορά στην έκταση του φαινομένου στην τοπική κλίμακα του Β. Αιγαίου. Συνυπολογίζοντας τα ευρήματα εκτιμάται ότι η εφαρμογή εναρμονισμένων αναλυτικών διαδικασιών είναι καθοριστική για τη μείωση της ετερογένειας μεταξύ των αποτελεσμάτων και τη διεξαγωγή ασφαλέστερων συμπερασμάτων. Ειδικότερα, η εναρμόνιση αφορά στην ανάλυση των ποσοτήτων αφθονίας και την περιγραφή των χαρακτηριστικών των μικροπλαστικών (όπως χρώμα και μέγεθος). Καθώς τα επιλεγμένα είδη ψαριών έχουν προταθεί ως κατάλληλοι οργανισμοί δείκτες για την περιγραφή της κατάποσης μικροπλαστικών στα διαφορετικά ενδιαιτήματα, η διερεύνηση της επίδρασης των βιολογικών χαρακτηριστικών των ψαριών κρίνεται απαραίτητη για την αποφυγή υπερ- ή υπό- εκτιμήσεων της αφθονίας των μικροπλαστικών. Η συστηματική παρακολούθηση περισσότερων του ενός είδους για κάθε ενδιαίτημα θα συμβάλλει στην καλύτερη κατανόηση των μεθόδων μέτρησης του επιπέδου της ρύπανσης των μικροπλαστικών στο θαλάσσιο περιβάλλον. Οι έρευνες σχετικά με τη βιοσυσσώρευση των αναφερόμενων ρύπων λαμβάνοντας υπόψη τα διαφορετικά χαρακτηριστικά μεταβολισμού του ψαριού κρίνονται απαραίτητες για την περαιτέρω εκτίμηση των επιπτώσεών τους. Τέλος, η ανάπτυξη και η εφαρμογή πλαισίων εκτίμησης των κινδύνων από τα μικροπλαστικά και τα χημικά τους πρόσθετα θα συμβάλλουν τόσο στην κατανόηση όσο και στην αντιμετώπιση του προβλήματος.