Oxidative stress and the DNA damage response/repair network in systemic autoimmune diseases

Abstract

Systemic autoimmune diseases comprise an heterogenous group and are characterized by aberrant chronic immune activation against self-antigens, production of autoantibodies and tissue injury. Although their pathophysiology remains unclear, several lines of evidence suggest that the imbalance between the oxidant and antioxidant cellular systems after exposure to deleterious stimuli, termed oxidative stress, is shown to be involved. Reactive oxygen and nitrogen species are key mediators of oxidative stress and may damage cellular DNA. To protect the genome, cells have developed several DNA repair mechanisms, composing the DNA damage response and repair network (DDR/R). On the other hand, chronological age, associated with a decline of the immune system functionality, leading to increased susceptibility to cancer and autoimmunity. Herein, we aimed to examine whether systemic autoimmunity is associated with aberrations in oxidative stress formation and DNA damage accumulation, as well as whether these aberrations may be attributed to the person’s chronological age. We studied 78 consecutive patients with systemic autoimmune diseases, including Rheumatoid Arthritis (RA) (n=9), Systemic Lupus Erythematosus (SLE) (n=14), Systemic Sclerosis (SSc) (n=9), Adamantiades – Behcet’s disease (ABD) (n=6) and Antiphospholipid Syndrome (APS) (n=40). A total of 212 apparently healthy individuals (HC) were studied in parallel. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated using standard methods. Oxidative stress formation was assessed by quantifying intracellular glutathione oxidation with chemiluminescent methods , DNA damage levels were measured by alkaline single-cell gel electrophoresis (single- and double- strand DNA breaks) and abasic (apurinic/apyrimidinic) sites using a chemiluminescent assays, while DNA damage repair efficacy was assessed by immunofluorescence antigen staining and confocal laser microscopy (double-strand break repair / DSB-R). Results from each patient subgroup were compared with corresponding results derived from an HC subgroup, matched 1:3 for age and sex. Firstly, increased oxidative stress levels were observed in RA, SLE, SSc, ABD and APS patients compared to HC (glutathione oxidation: RA: 46.2 ± 8,56 / HC: 70±10.7 [p<0.001], SLE: 49.86 ± 12.6 / HC: 70 ±8.6 [p<0.001], SSc: 52 ± 15.68 / HC: 67.29 ± 10.1, [p<0.01], ABD: 30.83 ± 8.33/ HC: 74.2 ± 8.54 [p<0.001] , APS: 44.86 ± 11.54 / HC: 69±11.33 [p<0.001]). Secondly, increased abasic site formation was observed in RA, SLE, SSc, ABD and APS patients compared to HC (abasic site formation: RA: 16.3 ± 3.2/ HC: 7.8±2.4 [p<0.001], SLE: 14.8±4 / HC: 7±2.4 [p<0.001], SSc: 12.56 ± 3.2 / HC: 7 ±2.4 [p<0.01], ABD: 23 ± 8.12/ HC: 5.7 ± 1.4 [p<0.001], APS: 16.6 ± 6.7/ HC: 7.3 ± 3.04 [p<0.001]). Abasic site formation strongly associated with intracellular oxidative stress levels in HCs and patients with systemic autoimmune diseases (HC: r=-0.555, p<0.001, Patients: r=-0.418, p<0.001). Thirdly, endogenous double-strand and single-strand DNA breaks were highly elevated in the PBMCs of patients with systemic autoimmune diseases, compared to HC (Olive Tail Moment: RA: 15.7±8.5 / HC: 6.2±1.7 [p<0.001], SLE: 9.7± 5.4 / HC: 4.7 ± 1.5 [p<0.001], SSc: 11.8 ± 8 / HC: 4.8± 1.8 [p<0.001], ABD: 9.4± 5.7 / HC: 4± 1.3 [p<0.01], APS: 14.5 ± 7.4 / HC: 5.3 ± 2 [p<0.001]). Collectively within patients, these elevated DNA damage levels strongly correlated with both the oxidative stress (r=-0.388, p<0.001) and abasic site levels (r=0.455, p<0.001) underlining a possible mechanistic link. Notably, a lack of correlation was observed between DNA damage repair capacity and oxidative stress levels in patients. DNA damage repair capacity correlated strongly with oxidative stress levels (r=-0.500, p<0.001) in healthy individuals, indirectly confirming the deficient DDR capacity in patients with systemic autoimmunity. Finally, chronological age was found to strongly associate with oxidative stress (r=0.636, p<0.001), DNA damage levels (r=0.641, p<0.001) and DDR capacity (r=0.781 , p<0.001) in HCs, but not in patients with systemic autoimmune diseases. In conclusion, we show that patients with systemic autoimmune diseases display increased oxidative stress, leading to increased DNA damage formation, and decreased DNA damage repair capacity. Such aberrations are not systemic autoimmune disease specific and are not influenced by the chronological age of the patient, as happens in the absence of autoimmunity.

Τα συστηματικά αυτοάνοσα νοσήματα συνιστούν μια ετερογενή ομάδα παθήσεων, οι οποίες χαρακτηρίζονται από χρόνια παρεκκλίνουσα ανοσολογική ενεργοποίηση έναντι αυτό-αντιγόνων, παραγωγή αυτοαντισωμάτων και ιστική καταστροφή. Αν και η παθοφυσιολογία της αυτοανοσίας παραμένει σκοτεινή, η ανισορροπία των οξειδωτικών και αντιοξειδωτικών κυτταρικών μηχανισμών μετά την έκθεση του κυττάρου σε επιβλαβή ερεθίσματα, που καλείται οξειδωτικό στρες, φαίνεται να συνεισφέρει στην κλινική εκδήλωση της αυτοανοσίας. Οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου και αζώτου, οι κύριοι οξειδωτικοί μεσολαβητές, μπορούν να μεταβάλουν την σύσταση του γονιδιώματος του κυττάρου, οδηγώντας σε βλάβες του DNA. Για την προστασία του γονιδιώματος, έχει αναπτυχθεί μια πληθώρα επιδιορθωτικών μηχανισμών του DNA που καλείται δίκτυο απόκρισης και επιδιόρθωσης βλαβών του DNA. Παράλληλα, η χρονολογική ηλικία του ατόμου έχει συσχετιστεί με την γήρανση του ανοσολογικού συστήματος, οδηγώντας σε αυξημένη πιθανότητα για καρκίνο και αυτοανοσία. Στην παρούσα μελέτη υποθέσαμε ότι τα συστηματικά αυτοάνοσα νοσήματα συσχετίζονται με ανωμαλίες του κυτταρικού οξειδωτικού στρες και αυξημένη συσσώρευση βλαβών του DNA και επιπλέον ελέγξαμε εάν οι παρεκκλίσεις συνδέονται με την ηλικία των ασθενών.Στην μελέτη αυτή αναλύσαμε 78 διαδοχικοί ασθενείς με συστηματικά αυτοάνοσα νοσήματα, συμπεριλαμβανομένων ασθενών με Ρευματοείδη Αρθρίτιδα (ΡΑ) (Ν=9), με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο (ΣΕΛ) (Ν=14), Συστηματική Σκλήρυνση (ΣΣ) (Ν=9), με Νόσο Αδαμαντιάδη – Behcet’s (ΝΒ) (Ν=6) και με Αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο (ΑΦΣ) (Ν=40). Παράλληλα, ένα σύνολο 212 φαινομενικά υγειών ατόμων (ΥΜ) αναλύθηκαν. Περιφερικά πολυμορφοπύρηνα κύτταρα απομονώθηκαν με τις συνήθεις μεθόδους. Το οξειδωτικό στρες ποσοτικοποιήθηκε μετρώντας την οξείδωση της ενδοκυττάριας γλουταθειόνης με μεθόδους χημειοφωταύγειας, τα επίπεδα βλαβών του DNA ποσοτικοποιήθηκαν μέσω της αλκαλικής ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων (δίκλωνα και μονόκλωνα θραύσματα DNA) και οι αβασικές (απουρινικές / απυριμιδινικές) θέσεις μέσω μεθόδων χημειοφωταύγειας, ενώ η ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA εκτιμήθηκε με μεθόδους ανοσοφθορισμού και συνεστιακής μικροσκοπίας. Τα αποτελέσματα από κάθε υποομάδα ασθενών συγκρίθηκαν με αντίστοιχη υποομάδα υγειών ατόμων, αφού είχε προηγηθεί 1:3 αντιστοιχία ηλικίας και φύλου.Πρώτον, αυξημένα επίπεδα οξειδωτικού στρες παρατηρήθηκαν σε ασθενείς με ΡΑ, ΣΕΛ, ΣΣ, ΝΒ και ΑΦΣ σε σύγκριση με ΥΜ (οξείδωση γλουταθειόνης: ΡΑ: 46.2 ± 8,56 / ΥΜ: 70±10.7 [p<0.001], ΣΕΛ: 49.86 ± 12.6 / ΥΜ: 70 ±8.6 [p<0.001], ΣΣ: 52 ± 15.68 / ΥΜ: 67.29 ± 10.1, [p<0.01] ΝΒ: 30.83 ± 8.33/ ΥΜ: 74.2 ± 8.54 [p<0.001] , ΑΦΣ: 44.86 ± 11.54 / ΥΜ: 69±11.33 [p<0.001]). Δεύτερον, αυξημένα επίπεδα σχηματισμού αβασικών θέσεων παρατηρήθηκαν σε ασθενείς με ΡΑ, ΣΕΛ, ΣΣ, ΝΒ και ΑΦΣ σε σύγκριση με ΥΜ (σχηματισμός αβασικών θέσεων: ΡΑ: 16.3 ± 3.2/ ΥΜ: 7.8±2.4 [p<0.001], ΣΕΛ: 14.8±4 / ΥΜ: 7±2.4 [p<0.001], ΣΣ: 12.56 ± 3.2 / ΥΜ: 7 ±2.4 [p<0.01], ΝΒ: 23 ± 8.12/ ΥΜ: 5.7 ± 1.4 [p<0.001], ΑΦΣ: 16.6 ± 6.7/ ΥΜ: 7.3 ± 3.04 [p<0.001]). Τρίτον, τα ενδογενή επίπεδα δίκλωνων και μονόκλωνων θραυσμάτων του DNA στους ασθενείς με τα εξεταζόμενα αυτοάνοσα νοσήματα ήταν σημαντικά αυξημένα σε σύγκριση με τους ΥΜ (Olive Tail Moment: ΡΑ: 15.7±8.5 / ΥΜ: 6.2±1.7 [p<0.001], ΣΕΛ: 9.7± 5.4 / ΥΜ: 4.7 ± 1.5 [p<0.001], ΣΣ: 11.8 ± 8 / ΥΜ: 4.8± 1.8 [p<0.001], ΝΒ: 9.4± 5.7 / ΥΜ: 4± 1.3 [p<0.01], ΑΦΣ: 14.5 ± 7.4 / ΥΜ: 5.3 ± 2 [p<0.001]). Συνολικά στους ασθενείς, τα αυξημένα επίπεδα των βλαβών του DNA ισχυρά συσχετίζονται τόσο με το οξειδωτικό στρες (r=-0.388 , p<0.001) όσο και με τα επίπεδα των αβασικών θέσεων (r=0.455, p<0.001), υποδηλώνοντας έναν πιθανό παθογενετικό μηχανισμό. Ιδιαιτέρα, η κυτταρική ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA δεν φαίνεται να συσχετίζεται με τα επίπεδα του οξειδωτικού στρες στου ασθενείς, σε αντίθεση με τους υγιείς μάρτυρες, εμμέσως επαληθεύοντας την μειωμένη ικανότητα επιδιόρθωσης στους ασθενείς με συστηματική αυτοανοσία. Τέλος, η ηλικία του ατόμου φαίνεται να συσχετίζεται σημαντικά τόσο με τα επίπεδα του οξειδωτικού στρες (r=0.636, p<0.001), τα επίπεδα βλαβών του DNA (r=0.641, p<0.001) και την κυτταρική ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA (r=0.781, p<0.001) στους υγιείς μάρτυρες αλλά όχι στους ασθενείς με συστηματικά αυτοάνοσα νοσήματα.Συνοψίζοντας, στην μελέτη αυτή δείχνουμε ότι οι ασθενείς με συστηματικά αυτοάνοσα νοσήματα εμφανίζουν αυξημένο οξειδωτικό στρες, αυξημένο σχηματισμό βλαβών του DNA και μειωμένη ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA. Αυτές οι διαταραχές φαίνεται να είναι μη-ειδικές για τα εξεταζόμενα συστηματικά αυτοάνοσα νοσήματα, αλλά και να μην επηρεάζονται από την ηλικία του ασθενούς, όπως συμβαίνει σε άτομα χωρίς αυτοανοσία.