Συγκριτική μελέτη της θεραπευτικής εφαρμογής βλαστοκυττάρων από ετερόλογους δότες ιστούς, στην ανάπλαση του αρθρικού χόνδρου σε πειραματικό μοντέλο κονίκλου

Abstract

Spontaneous regeneration of osteochondral defects (OD) with hyaline cartilage is impossible due to tissue avascularity and small cellular number. Therefore, cartilage trauma often results in degenerative processes of osteoarthritis, affecting joint mobility and the patient’s quality of life. Many therapeutic techniques, like microfracture and autologous chondrocyte implantation, have been applied but with many disadvantages, such as increased morbidity. Regenerative medicine has proposed the application of stem cells (SCs) for cartilage healing. Veterinary literature includes several studies about SCs usage, but most of them lack control groups, population homogeneity and a randomized, double-blinded design. Also, because of different protocols, duration and postoperative therapy, the comparison between the therapeutic properties of SCs is impossible. This randomized, controlled, double-blind study aimed to evaluate the osteochondrogenic potentials of rabbit allogeneic stem cells derived from adipose tissue (ASCs), bone marrow (BMSCs) and synovial membrane (SMSCs) encapsulated in fibrin glue in vivo. In addition, this study investigated the chondrogenic properties of fibrin glue in critical-sized osteochondral defects. A 3x3 mm-sized osteochondral defect was created in the femoral patellar on both knees of 48 healthy New Zealand rabbits, except from the left knees of 8 rabbits (control group) in which the osteochondral defects were 2x3mm. The rabbits were randomly divided into four groups: control (untreated) group (n=8), fibrin glue/fibrin glue with ACSs group (n=16), fibrin glue/fibrin glue with BMSCSs group (n=16), fibrin glue/fibrin glue with SDSCs group (n=16). After 12 weeks a macroscopic evaluation and a histology assessment were performed according to the International Cartilage Repair Society and O’Driscoll scale, accordingly. Also, immunohistochemical analysis of collagen II and aggrecan was completed. Finally, lactate dehydrogenase (LDH) was measured in the rabbits’ blood and synovial fluid. Statistical analysis revealed that fibrin glue caused a statistically significant improvement in the filling degree of the critical-sized OD and enhanced the production of reparative tissue with better macroscopic appearance and higher macroscopic score. On the contrary, it did not affect the histological and immunohistochemical score of the newly formed tissue, nor its degree of integration with the adjacent articular cartilage, except in group D, which showed significantly better fusion with the healthy cartilage compared to groups A and B. In addition, the enrichment of fibrin glue with ASCs, BMSCs and SDSCs significantly promoted the filling degree of critical-sized OD and the creation of tissue with better integration, superior macroscopic features, stronger expression of collagen II and higher macroscopic and histological scores. Specifically, SDSCs encapsulation into fibrin glue advanced significantly aggrecan expression. Additionally, the comparisons between MSCs revealed that ASCs, BMSCs and SDSCs in combination with fibrin glue resulted in a similar degree of critical-sized OD filling and generated newly formed tissue with higher integration and stronger collagen II expression. Besides, the implantation of SDSCs in combination with fibrin glue promoted the production of tissue with significantly superior macroscopic appearance and higher histological score compared to ASCs and BMSCs, while they significantly improved the macroscopic score compared to ASCs. Moreover, it was observed that the degree of filling in the 2x3mm OD was significantly better compared to the critical-sized defects. Also, reparative tissue’s integration with the healthy cartilage, macroscopic appearance and score, and histological and immunohistochemical composition were significantly improved. Furthermore, the integration degree of the newly formed tissue and its macroscopic score in small OD was found significantly better compared to the critical size ones, after the application of fibrin glue in combination with ASCs and BMSCs. Regenerative tissue’s appearance was significantly ameliorated compared to critical-sized OD after implantation of fibrin glue in combination with ASCs. Besides, LDH evaluation revealed that serum LDH in the group of empty OD was significantly lower at the baseline, while after the removal of outliers and application of the Bonferroni correction, the values became similar. Also, serum LDH was significantly increased from the baseline to the end of the study after implantation of fibrin glue in combination with SDSCs and ASCs. However, after the removal of outliers, serum LDH at the end of the study was significantly lower in the group of empty OD compared to animals that underwent MSCs implantation in combination with fibrin glue. Finally, no statistical difference was detected among synovial fluid LDH of different groups. In conclusion, the addition of fibrin glue improved the total score of the newly formed tissue into critical-sized OD, while the implantation of ASCs, BMSCs and SDSCs in combination with fibrin glue induced tissue formation with a significantly higher score compared to plain fibrin glue. In particular, SDSCs showed osteochondrogenetic superiority in vivo compared to ASCs. At the same time, the presence of MSCs led to serum LDH elevation probably due to the intense anaerobic metabolism or the intense cell apoptosis. Synovial fluid LDH is not a biomarker of articular cartilage healing. Finally, the tissue in small OD was superior compared to critical-sized OD whether they were left untreated or filled with ASCs and fibrin glue. To conclude, fibrin glue causes an improvement in the filling degree of the critical-sized OD (3x3 mm) and enhanced the production of reparative tissue with better macroscopic appearance and higher macroscopic score, but it does not affect the histological and the immunohistochemical score of the newly formed tissue, nor its degree of integration with the adjacent articular cartilage. However, the enrichment of fibrin glue with ASCs, BMSCs and SDSCs promotes the filling degree of OD and the creation of tissue with better integration, superior macroscopic features, stronger expression of collagen II and higher macroscopic and histological scores. Despite the fact that ASCs's, BMSCs's and SDSCs's transplantation in combination with fibrin glue result in a similar degree of OD filling and generated newly formed tissue with higher integration and stronger collagen II expression, SDSCs encapsulation into fibrin glue advances the aggrecan expression, the production of tissue with superior macroscopic appearance and histological score compared to ASCs and BMSCs, while they improve the total macroscopic score compared to ASCs. Additionally, the degree of filling, the reparative tissue’s integration, the macroscopic appearance and score, and the histological and immunohistochemical composition in the 2x3 mm OD is better compared to the critical-sized defects (3x3 mm). Furthermore, the integration degree of the newly formed tissue and its macroscopic score in small OD are better compared to the critical size ones, after the application of fibrin glue in combination with ASCs and BMSCs. Regenerative tissue’s appearance ameliorates compared to critical-sized OD after implantation of fibrin glue in combination with ASCs. Lastly, serum LDH increases from the baseline after the implantation of fibrin glue in combination with SDSCs and ASCs. However, after the removal of outliers, serum LDH is lower in the group of empty OD compared to the rabbits that undergo implantation of fibrin glue in combination with MSCs. On the contrary, synovial fluid LDH is not affected by the MSCs implantation nor the OD creation.

Η δυνατότητα αυτόματης αναγέννησής του αρθρικού χόνδρου με υγιή, υαλοειδή ιστό σε οστεοχόνδρινα ελλείμματα (ΟΕ) είναι περιορισμένη, λόγω της έλλειψης αγγειακού δικτύου και επαρκούς αριθμού χονδροκυττάρων. Ως αποτέλεσμα, οι κακώσεις αυτού του είδους δεν επουλώνονται και συχνά καταλήγουν να περιπλέκονται με τις εκφυλιστικές διαδικασίες της οστεοαρθρίτιδας (ΟΑ). Μέχρι σήμερα πολλές θεραπευτικές τεχνικές έχουν δοκιμασθεί, με κυριότερες τις χειρουργικές τεχνικές του μικροκατάγματος και της εμφύτευσης αυτόλογων χονδροκυττάρων, οι οποίες όμως εμφανίζουν σημαντικά μειονεκτήματα. Γι’ αυτό και η επιστημονική κοινότητα προσανατολίστηκε στη χρήση της εμβιομηχανικής των ιστών, όπως την εφαρμογή βλαστοκυττάρων (SCs). Στην κτηνιατρική, υπάρχουν αρκετές αναφορές σχετικά με την εφαρμογή των SCs στα ελλείματα του αρθρικού χόνδρου, αλλά οι περισσότερες από αυτές στερούνται ομάδας μαρτύρων, ομοιογένειας πληθυσμών και τυχαιοποιημένου, τυφλού σχεδιασμού. Επίσης, λόγω της διαφορετικότητας των πρωτοκόλλων που ακολουθούν, των μεθόδων αξιολόγησης που χρησιμοποιούν και της χρονικής διάρκειάς τους, η σύγκριση μεταξύ τους είναι σχεδόν αδύνατη. Σκοπός της παρούσας διπλά τυφλής, τυχαιοποιημένης και ελεγχόμενης με μάρτυρες έρευνας, είναι η συγκριτική μελέτη των θεραπευτικών ιδιοτήτων των βλαστοκυττάρων που προέρχονται από τον λιπώδη ιστό (ASCs), τον μυελό των οστών (BMSCs) και τον αρθρικό θύλακο (SDSCs) σε τεχνητά προκληθέντα ΟΕ σε κονίκλους. Στην έρευνα συμμετείχαν 56 θηλυκοί κόνικλοι, Νέας Ζηλανδίας, οι οποίοι χωρίστηκαν τυχαία σε 4 ομάδες. Στην ομάδα Α (n=8) δημιουργήθηκαν ΟΕ διαστάσεων 3x3 mm (κρίσιμο μέγεθος) στα δεξιά άκρα και 2x3 mm στα αριστερά, τα οποία παρέμειναν κενά. Στις υπόλοιπες ομάδες (n=16/ομάδα) δημιουργήθηκαν ΟΕ διαστάσεων 3x3 mm και στα δύο άκρα. Στα δεξιά άκρα τα ΟΕ πληρώθηκαν με κόλλα ινικής (ΚΙ), ενώ στα αριστερά εμφυτεύθηκαν ΑSCs με ΚΙ στην ομάδα Β, BMSCs με ΚΙ στην ομάδα Γ και SDSCs με ΚΙ στην ομάδα Δ. Μετά 12 εβδομάδες ο νεοσύστατος ιστός βαθμολογήθηκε μακροσκοπικά (κλίμακα International Cartilage Repair Society), ιστοπαθολογικά (κλίμακα O’Driscoll) και ανοσοϊστοχημικά (χρώσεις του κολλαγόνου ΙΙ και της αγκρεκάνης). Επίσης, τόσο κατά την έναρξη όσο και κατά τη λήξη των διαδικασιών πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις της γαλακτικής δεϋδρογενάσης (LDH) στο πλάσμα του αίματος και στο αρθρικό υγρό των κονίκλων.Τα κυριότερα συμπεράσματα της παρούσας έρευνας συνοψίζονται παρακάτω: Η προσθήκη ΚΙ σε κενά, κρίσιμου μεγέθους (3x3 mm), ΟΕ κονίκλων βελτιώνει τον βαθμό πλήρωσής τους, καθώς και τη μακροσκοπική εμφάνιση, το μακροσκοπικό σύνολο και τη συνολική μορφολογική εικόνα του νεοσύστατου ιστού. Η προσθήκη ΚΙ σε κρίσιμου μεγέθους (3x3 mm) κενά ΟΕ κονίκλων, δεν επηρεάζει την ιστολογική και την ανοσοϊστοχημική εικόνα του νεοσύστατου ιστού, αλλά ούτε και τον βαθμό ενσωμάτωσής του με τον γειτονικό αρθρικό χόνδρο .Ο εμπλουτισμός της ΚΙ με ASCs, BMSCs ή SDSCs σε κρίσιμου μεγέθους (3x3 mm) ΟΕ κονίκλων, προάγει τον βαθμό πλήρωσής τους, καθώς και την ανάπτυξη ιστού, ο οποίος εμφανίζει καλύτερη ενσωμάτωση με τον γειτονικό αρθρικό χόνδρο, ανώτερα μακροσκοπικά χαρακτηριστικά, υψηλότερο μακροσκοπικό σύνολο, βελτιωμένη ιστολογική σύσταση, εντονότερη χρώση για το κολλαγόνο ΙΙ και καλύτερη συνολικά μορφολογική εικόνα.Ο εμπλουτισμός της ΚΙ με SDSCs σε κρίσιμου μεγέθους (3x3 mm) ΟΕ κονίκλων, προάγει την ανάπτυξη ιστού με εντονότερη χρώση για την αγκρεκάνη, σε αντίθεση με τα ASCs και τα BMSCs.Ο εμπλουτισμός της ΚΙ με ASCs, BMSCs ή SDSCs σε κρίσιμου μεγέθους (3x3 mm) ΟΕ κονίκλων, οδηγεί σε παρόμοιο βαθμό πλήρωσής τους, καθώς και σε δημιουργία ιστού με παρόμοιο βαθμό ενσωμάτωσης με τον γειτονικό αρθρικό χόνδρο και έντασης της χρώσης για το κολλαγόνο ΙΙ. Ο εμπλουτισμός της ΚΙ με SDSCs σε κρίσιμου μεγέθους (3x3 mm) ΟΕ κονίκλων, οδηγεί στη δημιουργία ιστού με καλύτερη όψη επιφάνειας και ανώτερη ιστολογική σύσταση συγκριτικά με τα ASCs και τα BMSCs.Ο βαθμός πλήρωσης των μικρότερων του κρίσιμου μεγέθους κενών ΟΕ κονίκλων, είναι μεγαλύτερος συγκριτικά με των κενών κρίσιμου μεγέθους ΟΕ, όπως επίσης ανώτερος είναι ο βαθμός ενσωμάτωσης του νεοσύστατου ιστού, η όψη της επιφάνειάς του, το μακροσκοπικό σύνολό του, η ιστολογική και η ανοσοϊστοχημική σύστασή του, καθώς και η συνολική μορφολογική του εικόνα. Ο βαθμός ενσωμάτωσης του νεοσύστατου ιστού με τον υπόλοιπο αρθρικό χόνδρο των μικρότερων του κρίσιμου μεγέθους κενών ΟΕ κονίκλων, είναι ανώτερος συγκριτικά με των κρίσιμου μεγέθους (3x3 mm) ΟΕ κονίκλων, στα οποία εφαρμόστηκε ΚΙ σε συνδυασμό με ASCs ή BMSCs. Η όψη επιφάνειας και η συνολική μορφολογική εικόνα του νεοσύστατου ιστού των μικρότερων του κρίσιμου μεγέθους κενών ΟΕ κονίκλων, είναι καλύτερες συγκριτικά με των κρίσιμου μεγέθους (3x3 mm) ΟΕ κονίκλων, στα οποία εφαρμόστηκε ΚΙ σε συνδυασμό με ASCs. Η LDHορού αυξάνεται στους κονίκλους που υποβάλονται σε εμφύτευση ΚΙ σε συνδυασμό με SDSCs καθώς και με ASCs. Μετά την αφαίρεση των ακραίων τιμών, η LDHορού είναι χαμηλότερη στους κονίκλους με κενά ΟΕ συγκριτικά με τα ζώα που υποβάλονται σε εμφύτευση MSCs σε συνδυασμό με ΚΙ.Η LDHΑΥ δεν επηρεάζεται στους κονίκλους που υποβάλλονται σε εμφύτευση ΚΙ ή σε εμφύτευση MSCs σε συνδυασμό με ΚΙ. Επίσης, η LDHΑΥ δεν μεταβάλεται στους κονίκλους με κενά ΟΕ.