Development of novel enzymatic tools for the production of xylose- based products within a lignocellulosic biorefinery concept

Abstract

The overarching aim of this thesis was the development of a tailor made hemicellulolytic multi-functional enzyme that will target a complex hemicellulose-rich substrate. Hemicellulases are essential components of enzyme cocktails used in lignocellulose biorefineries, and as such are often proposed by commercial enzyme producers as option ‘cellulase boosters’. Biomass- acting enzymes are vital components of biorefinery processes and therefore, much effort has focused on the improvement of their characteristics (activity, stability, cost of production, etc) as well as on the discovery and/or development of novel enzymes. A bacterium that grows in an environment rich in cellulose and hemicelluloses is an ideal candidate to search for novel cellulolytic and hemicellulolytic enzymes. The use of metagenomics to probe hitherto unexplored microbial communities, notably those in animal gut environments has revealed a large number of multi-modular enzyme systems and novel examples of enzymatic diversity. A previous functional screening of a termite gut metagenomic library revealed an array of such multi-modular enzymes, including a particularly original GH10 xylanase. The special feature related to this enzyme was that two successive Carbohydrate Binding Modules were inserted within the catalytic GH10 domain, a domain organization known to create the so-called domain insertion proteins. In order to gain insights into the structure-function relationship of this unusual enzyme, homology modeling and Small Angle X-Ray Scattering were used to predict its structure. In addition, the full-length enzyme as well as a series of truncated variants was further biochemically characterized. This putative structure served as a blueprint for the rational design of a bi- functional chimeric enzyme where the CBM domains were replaced by a protein with xylosidase activity. This novel chimera was successfully overexpressed and it was shown that it retained both of the parental activities when it was assayed on a complex biomass substrate.

Ο πρωταρχικός στόχος αυτής της διατριβής ήταν η ανάπτυξη ενός "ειδικά σχεδιασμένου" ημικυτταρολυτικού πολυλειτουργικού ενζύμου που θα στοχεύει σε ένα πολύπλοκο υπόστρωμα πλούσιο σε ημικυτταρίνη. Οι ημικυτταρινάσες είναι βασικά συστατικά των κοκτέιλ ενζύμων που χρησιμοποιούνται σε βιοδιυλιστήρια λιγνοκυτταρίνης και ως εκ τούτου προτείνονται συχνά από εμπορικούς παραγωγούς ενζύμων ως «ενισχυτές» της δράσης των κυρίως κυτταρινασών.Τα ένζυμα που έχουν ως υπόστρωμα τη βιομάζα είναι ζωτικά συστατικά των διεργασιών του βιοδιυλιστηρίου και επομένως, μεγάλη προσπάθεια έχει επικεντρωθεί στη βελτίωση των χαρακτηριστικών τους (δραστηριότητα, σταθερότητα, κόστος παραγωγής, κ.λπ.) καθώς και στην ανακάλυψη ή/και ανάπτυξη νέων ενζύμων. Ένα βακτήριο που αναπτύσσεται σε περιβάλλον πλούσιο σε κυτταρίνη και ημικυτταρίνες είναι ιδανικός υποψήφιος για την αναζήτηση νέων κυτταρολυτικών και ημικυτταρολυτικών ενζύμων. Η χρήση της μεταγονιδιωματικής για την ανίχνευση μικροβιακών κοινοτήτων που μέχρι τώρα δεν έχουν εξερευνηθεί, ιδιαίτερα εκείνων σε περιβάλλοντα ζωικού εντέρου, έχει αποκαλύψει έναν μεγάλο αριθμό ενζυμικών συστημάτων που αποτελούνται από πολλαπλές επικράτειες και νέα παραδείγματα ενζυματικής ποικιλομορφίας. Ένας προηγούμενος έλεγχος (screening) για νέες λειτουργίες μιας μεταγονιδιωματικής βιβλιοθήκης εντέρου τερμιτών αποκάλυψε μια σειρά τέτοιων ενζύμων (που αποτελούνται από πολλαπλές επικράτειες), συμπεριλαμβανομένης μιας ιδιαίτερα πρωτότυπης ξυλανάσης GH10. Το ιδιαίτερο χαρακτηριστικό που σχετίζεται με αυτό το ένζυμο ήταν ότι δύο διαδοχικές επικράτειες δέσμευσης υδατανθράκων (CBM domains) παρεμβάλλονται εντός της καταλυτικής επικράτειας (GH10 domain), μιας οργάνωση επικρατειών με την οποίο, είναι γνωστό, ότι δημιουργούνται οι λεγόμενες πρωτεΐνες παρεμβαλόμενης επικράτειας. Προκειμένου να αποκτηθούν πληροφορίες σχετικά με τη σχέση δομής-λειτουργίας αυτού του ασυνήθιστου ενζύμου, χρησιμοποιήθηκαν μοντελοποίηση ομολογίας (homology modeling) και Σκέδαση ακτίνων Χ μικρής γωνίας (SAXS) για την πρόβλεψη της δομής του. Επιπλέον, το ένζυμο πλήρους μήκους καθώς και μια σειρά από μικρότερου μήκους παραλλαγές του χαρακτηρίστηκαν περαιτέρω βιοχημικά. Αυτή η υποθετική δομή χρησίμευσε ως βάση για τον ορθολογικό σχεδιασμό ενός διλειτουργικού χιμαιρικού ενζύμου όπου οι επικράτειες CBM αντικαταστάθηκαν από μια πρωτεΐνη με δραστηριότητα ξυλοσιδάσης. Αυτή η νέα χίμαιρα υπερεκφράστηκε με επιτυχία και αποδείχθηκε ότι διατήρησε και τις δύο γονικές ενζυμικ΄πες δραστικότητες όταν αναλύθηκε σε ένα πολύπλοκο υπόστρωμα βιομάζας.