Analysis of the mechanisms of function of T-cell products in cellular immunotherapy

Abstract

Allogeneic haematopoietic cell tranplantation (Allo-HCT) has become a standard treatment for patients with marrow failure syndromes and hematologic malignancies such as acute leukaemia. However, this treatment is frequently accompanied by the occurrence of Graft-versus-Host Disease (GvHD), a common life-threatening complication in which donor-derived T cells recognise and attack the host’s normal tissues. This phenomenon can occur either early (aGvHD) or later (cGvHD) following allo-HCT and can transpire even when aggressive immunosuppressive prophylaxis is given or even when the donor is an HLA-matched sibling. Despite ground-breaking discoveries in GvHD pathobiology and advances in our understanding of the underlying mechanisms of this disease, conventional immunosuppressive pharmacotherapy remains the backbone of GvHD prophylaxis and treatment. A promising alternative strategy against GvHD is immunotherapy employing the adoptive transfer of T-cells with regulatory properties (Tregs) as a living drug aiming to avoid prolonged pharmacological immunosuppression while preserving the beneficial Graft-versus-Leukaemia effect. Our approach aspired to mimic the physiological mechanism of the successful immune tolerance transpiring during pregnancy, where HLA-G -a well-known immunoregulatory molecule- is expressed in the placenta thereby guarding the “semi-allogeneic” fetus from maternal immune rejection. Since the HLA-G gene is epigenetically repressed after prenatal life and the methylation status of HLA-G promoter regulates its transcriptional activity, we showed in small-scale in vitro experiments that exposure of human peripheral T cells to hypomethylating agents (Has) induces a de novo and stable expression of HLA-G, in turn, converting them to Tregs with in vitro immunosuppressive functions. Subsequently, we developed and validated the manufacturing process of a HLA-G+ T cell (G+ cell)-enriched product, termed iG-Tregs, using a clinical scale and GMP-grade protocol. iG-Tregs can be consistently and robustly produced and display suppressive properties with a favourable safety profile both in vitro and in vivo. The current thesis plays a pivotal part in the translation journey of iG-Tregs as it focuses on elucidating the molecular aspects of G+ cell biology, the design of an interventional clinical trial to translate iG-Tregs as adoptive cell immunotherapy in the context of GvHD post allo-HCT and finally to provide a framework upon which to gain insight into the biological events occurring following this treatment in the human in vivo setting.

Η αλλογενής μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων (Allo-HCT) αποτελεί μια καθιερωμένη θεραπεία για ασθενείς με σύνδρομα μυελικής ανεπάρκειας και αιματολογικές κακοήθειες όπως η οξεία λευχαιμία. Ωστόσο, αυτή η θεραπεία συχνά συνοδεύεται από την εμφάνιση της νόσου του μοσχεύματος έναντι του ξενιστή (GvHD), μιας απειλητικής για τη ζωή επιπλοκής στην οποία τα Τ κύτταρα που προέρχονται από τον δότη αναγνωρίζουν και επιτίθενται τους φυσιολογικούς ιστούς του ξενιστή. Αυτό το φαινόμενο μπορεί να συμβεί είτε νωρίς (acute GvHD) είτε αργότερα (chronic GvHD) μετά από την allo-HCT και μπορεί να εμφανιστεί ακόμη και όταν χορηγείται ισχυρή ανοσοκατασταλτική προφύλαξη ή ακόμα και όταν ο δότης είναι HLA συμβατός αδερφός. Παρά τις πρωτοποριακές ανακαλύψεις στην παθοβιολογία της GvHD και τις προόδους στην κατανόηση των υποκείμενων μηχανισμών αυτής της νόσου, η συμβατική ανοσοκατασταλτική φαρμακοθεραπεία παραμένει η κύρια παρέμβαση για την προφύλαξη και θεραπεία έναντι της GvHD. Μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική στρατηγική κατά της GvHD είναι η ανοσοθεραπεία που χρησιμοποιεί τη υιοθετούμενη θεραπεία με Τ ρυθμιστικά κύτταρα (Tregs) ως ζωντανό φάρμακο με στόχο την αποφυγή παρατεταμένης φαρμακολογικής ανοσοκαταστολής διατηρώντας παράλληλα το ευεργετικό αποτέλεσμα Μοσχεύματος έναντι Λευχαιμίας.Η προσέγγισή μας φιλοδοξούσε να μιμηθεί τον φυσιολογικό μηχανισμό της επιτυχούς ανοσολογικής ανοχής που λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης, όπου το HLA-G -ένα πολύ γνωστό ανοσορυθμιστικό μόριο- εκφράζεται στον πλακούντα προστατεύοντας έτσι το «ημι-αλλογενές» έμβρυο από μητρική ανοσολογική απόρριψη. Δεδομένου ότι το γονίδιο HLA-G καταστέλλεται επιγενετικά και ότι η μεθυλίωση του εκκινητή του γονιδίου ρυθμίζει τη μεταγραφική του δραστηριότητα, δείξαμε σε μικρής κλίμακας in vitro πειράματα ότι η έκθεση ανθρώπινων περιφερικών Τ κυττάρων σε υπομεθυλιωτικούς παράγοντες (HA) επάγει de novo και σταθερή έκφραση του HLA-G, μετατρέποντάς τα σε Tregs με in vitro ανοσοκατασταλτικές λειτουργίες. Στη συνέχεια, αναπτύξαμε και επικυρώσαμε τη διαδικασία κατασκευής ενός προϊόντος εμπλουτισμένου με HLA-G+ T κύτταρα (G+ κύτταρα), που ονομάζεται iG-Tregs, χρησιμοποιώντας ένα κλινικής κλίμακας και GMP-βαθμού πρωτόκολλο. Τα παραγόμενα iG-Tregs εμφανίζουν κατασταλτικές ιδιότητες με ευνοϊκό προφίλ ασφάλειας τόσο in vitro όσο και in vivo.Η παρούσα διατριβή παίζει καθοριστικό ρόλο στο μεταφραστικό ταξίδι των iG-Tregs καθώς εστιάζει στην αποσαφήνιση των μοριακών πτυχών της κυτταρικής βιολογίας των G+ κυττάρων, στο σχεδιασμό μιας παρεμβατικής κλινικής δοκιμής για τη μετάφραση των iG-Tregs ως υιοθετούμενης κυτταρικής ανοσοθεραπείας έναντι της ανάρτησης GvHD σε ασθενείς που υποβάλλονται σε allo-HCT και τέλος στην ανάπτυξη ενός πλαισίου ανοσολογικής επιτήρησης των ασθενών για την αποσαφήνιση των βιολογικών γεγονότων που συμβαίνουν μετά από τη χορήγηση iG-Tregs in vivo.