Μοριακή διερεύνηση της έκφρασης των miRnas που ρυθμίζουν το ανοσιακό μονοπάτι PD-1/PD L-1 σε προκαρκινικές αλλοιώσεις και καρκινώματα τραχήλου μήτρας

Abstract

Cervical cancer ranks third among all cancers in women worldwide. Immune checkpoints are networks of inhibitory and stimulatory pathways that support immune response and sustain self-tolerance. Immune checkpoint mechanisms are frequently triggered in cancer to block the development of anti-tumor immune responses. Programmed cell death protein 1 (PD-1) is a transmembrane protein and Its ligand (PDL-1) is usually expressed by macrophages, some activated T cells, B cells, dendritic cells, and epithelial cells under inflammatory conditions. It is also expressed by tumor cells in order to avoid anti-tumor immune responses. PD-1/PDL1 launches self-tolerance by downregulating the immune system’s response and by suppressing T-cell inflammatory activity. In this study, computationally predicted miRNAs that according to specific algorithm-based online tools bind to the 3’ UTR of PDL-1 mRNA were chosen, and their expression profile on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) clinical samples of different histological categories was explored. The initial hypothesis was that if the studied miRNAs are capable of targeting PDL-1 mRNA and subsequently inhibiting its production, downregulation of studied miRNAs in high-grade lesions could be one of the reasons that PDL-1 is overexpressed, thus suggesting possible potential powerful candidates for therapeutic intervention. Among the studied miRNAs, hsa-Mir-125-5p was found to be significantly underexpressed in high-grade lesions, prompting further investigation into its potential involvement in the molecular pathway that includes the E6 oncogene of HPV16 and the PD-L1 protein. By applying the CRISPR/Cas9 system to cell line models, it was demonstrated that a decrease in E6 expression leads to an increase in hsa-Mir-125-5p expression and a reduction in PD-L1 protein levels. This suggests a molecular pathway where the presence of HPV16 may function to modulate hsa-Mir-125-5p and, specifically, its effect on the PD-L1 protein.

Ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας κατέχει την τρίτη θέση μεταξύ όλων των κακοήθων νεοπλασμάτων στις γυναίκες παγκοσμίως. Τα σημεία ελέγχου του ανοσοποιητικού συστήματος είναι δίκτυα μονοπατιών που υποστηρίζουν την ανοσολογική απόκριση και διατηρούν την αυτοανοχή. Οι μηχανισμοί σημείων ελέγχου του ανοσοποιητικού συστήματος ενεργοποιούνται συχνά στον καρκίνο για να εμποδίσουν την ανάπτυξη ανοσολογικών αποκρίσεων. Η πρωτεΐνη προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου 1 (PD-1) είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη και ο συνδέτης της (PDL-1) εκφράζεται συνήθως από μακροφάγα, μερικά ενεργοποιημένα Τ κύτταρα, Β κύτταρα, δενδριτικά κύτταρα και επιθηλιακά κύτταρα υπό φλεγμονώδεις συνθήκες και επίσης εκφράζεται από καρκινικά κύτταρα. Το PD-1/PDL1 εκτοξεύει την αυτοανοχή μειώνοντας την απόκριση του ανοσοποιητικού συστήματος και καταστέλλοντας τη φλεγμονώδη δραστηριότητα των Τ-κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, επιλέχθηκαν miRNA με βάση on line υπολογιστικά εργαλεία, τα οποία βασίζονται σε αλγόριθμους που ελέγχουν την πρόσδεση αυτών με την 3' UTR του PDL-1 mRNA και διερευνήθηκε το προφίλ έκφρασής τους σε κλινικά δείγματα εγκλεισμένα σε παραφίνη διαφορετικών ιστολογικών κατηγοριών. Η αρχική υπόθεση ήταν ότι εάν τα miRNA που μελετήθηκαν είναι ικανά να στοχεύουν το mRNA του PDL-1 και στη συνέχεια να αναστέλλουν την παραγωγή του, η αρνητική ρύθμιση των μελετηθέντων miRNAs σε βλάβες υψηλού βαθμού θα μπορούσε να είναι ένας από τους λόγους που το PDL-1 υπερεκφράζεται, καθιστώντας τους έτσι πιθανούς ισχυρούς υποψηφίους για θεραπευτική παρέμβαση. Από τα μελετηθέντα miRNA, το hsa-Mir-125-5p βρέθηκε να υποεκφράζεται σε υψηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακές αλλοιώσεις του πλακώδους επιθηλίου και επιλέχθηκε ώστε να ελεγχθεί περαιτέρω η πιθανότητα να εμπλέκεται στο μηχανιστικό μονοπάτι που περιλαμβάνει το Ε6 ογκογονίδιο του HPV16 και την πρωτεΐνη PDL-1. Εφαρμόζοντας κατάλληλο σύστημα CRISPR/Cas9 σε κυτταρικές σειρές-μοντέλα, δείχθηκε ότι μείωση της έκφρασης του Ε6 οδηγεί σε αύξηση της έκφρασης του hsa-Mir-125-5p και μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης PDL-1 προτείνοντας έτσι, ένα μοριακό μονοπάτι όπου η παρουσία του ιού HPV16 μπορεί να λειτουργήσει έτσι ώστε το hsa-Mir-125-5p να μπορεί να επηρεάσει στο στόχο του και συγκεκριμένα στην προκειμένη περίπτωση την πρωτεΐνη PD-L1.