Η σχέση του μεταβολομικού προφίλ του αμνιακού υγρού με τον πρόωρο τοκετό

Abstract

Introduction. Preterm delivery (PTD) is a notable pregnancy complication, affecting one out of every ten births. This study set out to investigate whether analyzing the metabolic composition of amniotic fluid (AF) collected from pregnant women during the second trimester of pregnancy could offer valuable insights into prematurity. Aim: In this prospective observational study, we aimed to determine the composition of amniotic fluid metabolites and their potential as prognostic indicators for preterm labour. The study analyzed frozen amniotic fluid samples obtained from amniocentesis during the second trimester of pregnancy. 1HRNMR was used to detect all metabolites in the samples and evaluate their changes in relation to the outcome of pregnancy, the pregnant women's dietary habits, and pregnancy pathology. Materials and Methods. This prospective cohort study investigated AF samples between 2013 and 2014 at the Third Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Faculty of Health Sciences, Aristotle University of Thessaloniki, Greece. The NMR spectra were acquired at 300K, after a 5min resting period for temperature stabilization, on a Bruker Ascend 500MHz NMR spectrometer equipped with a 5mm double resonance broadband inverse (BBI) detection probe. All 1H NMR spectra were phase-corrected using TopSpin 4.1.4 software. Chemical shift calibration, baseline correction, S/N ratio identification as well as alignment normalization and bucketing was done with NMRProcFlow open access web tool . The statistical significance level was set at 5%. The demographics were statistically analyzed with SPSS v.26. The MetaboAnalyst 5.0 was utilised for both univariate/multivariate analyses as well as pathway analysis. Results. Out of a total of 97 women, 83 samples were of good quality for metabolomics analysis, with the majority of deliveries being normal. Statistical analysis revealed metabolic differences between samples from normal preterm birth, but pathological samples were excluded due to their high heterogeneity. In total, 60 AF samples were used in the analyses; 43 were term and 17 were preterm. The mean duration of gestation was 38.5 (±0.9) weeks for term and 35.3 (±2.8) weeks for the preterm group (p<0.001). Similarly, the mean birthweight was statistically different with term neonates having a mean birthweight of 3,340g (±380.77) while the preterm ones weighed 2,695g (±553.85) (p<0.001). 27 metabolites including aliphatic and aromatic amino acids, sugars and organic acids were assigned by the combination of 2D NMR spectroscopy (2D-HSQC, 2D TOCSY), available online tools such as Metabominer and literature data. Principal Component Analysis (PCA) was conducted on the annotated NMR profile (170 annotated intelligent buckets) revealed a pattern between the two studied groups along the first principal component, accounting for 34.3% of the metabolic variance in the studied AF samples. The objective of this analysis was to find an association between second trimester amniotic fluid metabolites and the probability of preterm delivery. Three components achieved strong separation, and discrimination analysis identified significant metabolites that differentiated the two groups. The metabolites dimethyl-glycine, glucose, succinic acid, and myo-inositol were the most prominent markers for distinguishing between normal and preterm birth groups. Subsequent analysis using a volcano plot showed the fluctuations in these metabolites, with alpha and beta-glucose, dimethyl-glycine, and myo-inositol showing increased concentration in the preterm group, while glutamic acid, isoleucine, choline, lysine, acetate salt, citrate salt, and tyrosine showed decreased concentration. These metabolites were found to be involved in several pathways, including aminoacyl-tRNA biosynthesis, alanine, aspartate and glutamate metabolism, and glyoxylate and dicarboxylate metabolism. Conclusion. The research employed 1H-NMR metabolomics to examine AF samples obtained from women who gave birth prematurely and women who delivered at full term. The application of multivariate analysis revealed metabolites (Dimethylglycine, Glucose, Myo-inositol, and Succinate) that can serve as possible biomarkers for the prognosis and early diagnosis of preterm delivery. Additionally, pathway analysis unveiled the most critical metabolic pathways relevant to our re-search hypothesis. In summary, these findings suggest that the metabolic composition of AF in the second trimester can be a potential indicator for identifying biomarkers associated with the risk of preterm delivery.

Εισαγωγή. Ο πρόωρος τοκετός είναι μια αξιοσημείωτη επιπλοκή της εγκυμοσύνης, η οποία επηρεάζει έναν στους δέκα τοκετούς. Η παρούσα μελέτη είχε ως στόχο να διερευνήσει κατά πόσον η ανάλυση της μεταβολικής σύνθεσης του αμνιακού υγρού που συλλέγεται από έγκυες γυναίκες κατά το δεύτερο τρίμηνο της εγκυμοσύνης θα μπορούσε να προσφέρει πολύτιμες πληροφορίες για την προωρότητα. Σκοπός. Σε αυτή την προοπτική μελέτη παρατήρησης, στόχος μας ήταν να προσδιορίσουμε τη σύνθεση των μεταβολιτών του αμνιακού υγρού και τη δυνατότητά τους ως προγνωστικών δεικτών για τον πρόωρο τοκετό. Η μελέτη ανέλυσε κατεψυγμένα δείγματα αμνιακού υγρού που ελήφθησαν από αμνιοπαρακέντηση κατά τη διάρκεια του δεύτερου τριμήνου της εγκυμοσύνης. Χρησιμοποιήθηκε 1HRNMR για την ανίχνευση όλων των μεταβολιτών στα δείγματα και την αξιολόγηση των μεταβολών τους σε σχέση με την έκβαση της εγκυμοσύνης, τις διατροφικές συνήθειες των εγκύων και την παθολογία της εγκυμοσύνης. Υλικά και μέθοδο. Αυτή η προοπτική μελέτη κοόρτης διερεύνησε δείγματα ΑΥ μεταξύ 2013 και 2014 στην Γ' Μαιευτική και Γυναικολογική Κλινική της Ιατρικής Σχολής της Σχολής Επιστημών Υγείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, Ελλάδα. H φασματογραφία έγινε στους 300K, σε φασματόμετρο NMR Bruker Ascend 500MHz, εξοπλισμένο με καθετήρα ανίχνευσης ευρυζωνικής αντίστροφης ανίχνευσης (BBI) διπλού συντονισμού 5mm. Όλα τα φάσματα 1H NMR διορθώθηκαν με τη χρήση του λογισμικού TopSpin 4.1.4. και οι σχετικές διορθώσεις με το NMRProcFlow. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε στο 5%. Τα δημογραφικά στοιχεία αναλύθηκαν στατιστικά με το SPSS v.26 . Το MetaboAnalyst 5.0 χρησιμοποιήθηκε τόσο για μεταβολομικές αναλύσεις όσο και για ανάλυση βιοχημικών μεταβολικών μονοπατιών. Αποτελέσματα. Από το σύνολο των 97 γυναικών, 83 δείγματα ήταν καλής ποιότητας για μεταγεννητική ανάλυση. Οι εγκυμοσύνες οδήγησαν σε αρσενικά και θηλυκά νεογνά, με την πλειονότητα των τοκετών να είναι φυσιολογικοί. Η στατιστική ανάλυση αποκάλυψε μεταβολικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων από φυσιολογικό πρόωρο τοκετό, αλλά τα παθολογικά δείγματα αποκλείστηκαν λόγω της μεγάλης ετερογένειάς τους. Συνολικά, 60 δείγματα αμνιακού υγρού χρησιμοποιήθηκαν στις αναλύσεις. 43 ήταν τελειόμηνα και 17 πρόωρα. Η μέση διάρκεια κύησης ήταν 38,5 (±0,9) εβδομάδες για την ομάδα των τελειόμηνων και 35,3 (±2,8) εβδομάδες για την ομάδα των πρόωρων (p<0,001). Ομοίως, το μέσο βάρος γέννησης ήταν στατιστικά διαφορετικό με τα τελειόμηνα νεογνά να έχουν μέσο βάρος γέννησης 3.340g (±380,77) ενώ τα πρόωρα ζύγιζαν 2.695g (±553,85) (p<0,001). 27 μεταβολίτες, συμπεριλαμβανομένων αλειφατικών και αρωματικών αμινοξέων, σακχάρων και οργανικών οξέων, αποδόθηκαν με το συνδυασμό φασματοσκοπίας 2D NMR (2D-HSQC, 2D TOCSY), διαθέσιμων διαδικτυακών εργαλείων όπως το Metabominer και βιβλιογραφικών δεδομένων. Η ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) που διεξήχθη στο σχολιασμένο προφίλ NMR αποκάλυψε τρεις συνιστώσες που πέτυχαν ισχυρό διαχωρισμό και η ανάλυση διάκρισης εντόπισε σημαντικούς μεταβολίτες που διαφοροποιούσαν τις δύο ομάδες. Οι μεταβολίτες διμεθυλ-γλυκίνη, γλυκόζη, σουκκινικό οξύ και μυο-ινοσιτόλη ήταν οι σημαντικότεροι δείκτες για τη διάκριση μεταξύ των ομάδων φυσιολογικού και πρόωρου τοκετού. Η επακόλουθη ανάλυση με τη χρήση ενός διαγράμματος ηφαιστείου έδειξε τις διακυμάνσεις αυτών των μεταβολιτών, με την α- και β-γλυκόζη, τη διμεθυλογλυκίνη και τη μυο-ινοσιτόλη να παρουσιάζουν αυξημένη συγκέντρωση στην ομάδα των πρόωρων, ενώ το γλουταμινικό οξύ, η ισολευκίνη, η χολίνη, η λυσίνη, το οξικό άλας, το κιτρικό άλας και η τυροσίνη παρουσίασαν μειωμένη συγκέντρωση. Τέλος, πραγματοποιήθηκε χαρτογράφηση των μεταβολικών μονοπατιών. Αυτοί οι μεταβολίτες βρέθηκαν να εμπλέκονται σε διάφορα μονοπάτια, όπως η βιοσύνθεση αμινοακυλο-tRNA, ο μεταβολισμός της αλανίνης, του ασπαρτικού και του γλουταμινικού, καθώς και ο μεταβολισμός του γλυοξυλικού και του δικαρβοξυλικού. Συμπέρασμα. Η έρευνα χρησιμοποίησε μεταβολομική ανάλυση με 1H-NMR για να εξετάσει δείγματα ΑΥ που ελήφθησαν από γυναίκες που γέννησαν πρόωρα και γυναίκες που γέννησαν φυσιολογικά. Η εφαρμογή πολυμεταβλητής ανάλυσης κύριων συνιστωσών αποκάλυψε μεταβολίτες (διμεθυλογλυκίνη, γλυκόζη, μυο-ινοσιτόλη και σουξινικό οξύ) που μπορούν να χρησιμεύσουν ως πιθανοί βιοδείκτες για την πρόγνωση και την έγκαιρη διάγνωση του πρόωρου τοκετού. Επιπλέον, η ανάλυση βιοχημικών μεταβολικών μονοπατιών αποκάλυψε τα πιο κρίσιμα μεταβολικά μονοπάτια. Συνοπτικά, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η μεταβολική σύνθεση του αμνιακού υγρού στο δεύτερο τρίμηνο της κυήσεως μπορεί να αποτελέσει πιθανό δείκτη για τον εντοπισμό βιοδεικτών που σχετίζονται με τον κίνδυνο πρόωρου τοκετού.