Study of the role of vine and vinification microbiome from local grapevine cultivars on winemaking and the final wine quality

Abstract

Grapevine phyllosphere and carposphere harbors microbial communities whose assemblage mechanisms are under the direct influence of the inner and outer plant environment. The epiphytic grapevine microbiome has a notable influence on plant performance and physiology and further on the vinification process and final wine quality. Its structure and composition can vary significantly depending on different vineyard mediated factors with clear reflections both on plant health and on the winemaking process. In this thesis we aimed to disentangle the factors and conditions that determine the composition of the epiphytic (phyllospheric and carpospheric) grapevine microbiome and the wood grapevine microbiome, with the latter focusing on its role in the establishment of grapevine trunk diseases (GTDs). Further, we determined, under near full scale spontaneous and commercial vinification conditions, the influence of vineyard mediated and vinification associated factors on microbial succession and on the antioxidant, antimutagenic and anticancer profile of the produced wines facilitating the establishment of correlations between vinification microbiome and wine properties. Finally, we explored in spontaneous and inoculated vinifications microbial succession (via amplicon sequencing) and the metabolic pathways and functions employed by the vinification microbiota to cope with the fermentation conditions and lead to the production of wine (via metatranscriptomic analysis).Firstly, we assessed the wood microbiome of grapevines asymptomatic and symptomatic to GTDs in three major Greek cultivars each cultivated at geographically different zones. We noticed that biogeography/cultivar (lumped factor) was the main determinant of both fungal and bacterial communities, while the GTD status, differentiated asymptomatic from symptomatic vines only in the cultivar Xinomavro, demonstrating its higher resistance towards GTDs an d thus complex interactions of cultivar biogeography. Moreover, we observed a cultivar dependent association of P. chlamydospora, Κ. variispora, Fomitiporia spp and Diaporthe all previously proposed as GTDs causal agents with symptomatic grape vines suggesting their direct involvement in the establishment of GTDs. Random forest analysis identified P. chlamydospora, Κ. variispora, along with Cladosporium spp. and A. alternata as early and accurate predictors of GTDs, offering a valuable microbiome mediated analytical tools for early identification of GTDs in vineyards. As for the bacterial microbiome, the notable negative co-occurrence of Bacillus and Streptomyces with Phaemoniella, Phaeoacremonium and Seimatosporium, members of the GTD pathobiome, in asymptomatic grape vines suggested a potential suppressive role of these bacterial towards GTDs that needs to be further verified through directed isolation and further characterization of their suppressive potential in vitro and in planta. Secondly, we analyzed, via amplicon sequencing, the epiphytic (carposphere and phyllosphere) grapevine microbiome in four emblematic Greek grapevine cultivars, at different geographical scales aiming to unravel the effects of different structural factors on the composition of the grapevine microbiome. When looking at larger geographical scales, across different viticultural zones biogeography was the main determinant of the epiphytic fungal and bacterial communities. However, at regional scales, within the same viticultural zone of Aigialeia, cultivar becomes the most important determinant factor. When the analysis was performed separately for each of the two studied cultivars in the viticultural zone of Aigialeia (cv. Roditis and Sideritis) strong effects of the terroir units were evident. In addition, the epiphytic fungal grapevine microbiota exhibited stronger responses to the studied factors and clear distance decay patterns at both studied scales, unlike the bacterial community which showed weaker responses to the confounding factors and weak distance decay patterns. Thirdly, we extended our study and we investigated the effects of vineyard mediated factors on vinification microbiome under different vinification strategies, directly relevant to current winemaking practices. We showed that under realistic scale wise and process wise wine making practices, vineyard mediated factors, such as cultivar and vintage, remain operative along the vinification process, unlike terroir whose effect, although significant at start (in vineyard and early fermentation stages), becomes less important as fermentation progresses. The strategy of vinification employed also strongly influenced the composition of the vinification microbiota, with the effect varying between fungi and bacteria. The fungal community showed a universal pattern of NS yeasts and filamentous fungi dominating at the early stages of fermentation being displaced, though by indigenous or inoculated Saccharomyces strains as the fermentation progresses. On the other hand, bacterial community succession varied, with the most common pattern mirrored in an initially rich in AAB bacterial community replaced by Oenococcus at the end of fermentation. Vintage and vinification type were also the stronger determinants of the antioxidant, anticancer and antimutagenic profile of the produced wines. Further analysis identified significant and universal across cultivars, positive correlations between members of the vinification microbiota like the NS yeasts Torulaspora debrueckii and Lachancea quebecensis with the anticancer and the antioxidant properties of wines. These findings could be exploited towards a microbiota modulated vinification process that will lead to high quality wines with desirable properties and enhanced regional identity. Finally, we evaluated, in spontaneous and commercial vinifications (both being amended with preservatives) with grapes of the Greek cultivar Vidiano, the composition and succession of the fungal and bacterial microbiome and explored, via metatranscriptomic analysis, the metabolic pathways and functions employed by the vinification microbiome along the fermentation. The stage of vinification was identified as the most important structural factor of the vinification microbiome while the type of vinification process employed also contributed but to a lower extent, being most probably a result of the universal use of preservatives in both vinifications. The fungal community showed a wide phylogenetic diversity of NS yeasts and Saccharomyces at early fermentation stages which was replaced by the complete dominance of inoculated or indigenous Saccharomyces strains as the fermentation progressed. The bacterial community was composed of LAB and AAB, with Oenococcus showing a progressive increase along the fermentation process. Metatranscriptomic analysis reinforced the strong influence of vinification stage on the metabolic activity of the microbiome. When data from the different fermentation stages were analyzed separately, we noted strong signatures of the different vinification strategies employed (spontaneous and inoculated) at the first and middle stages of fermentation. Overall, we noted upregulation of genes mostly originated from S. cerevisiae and other yeasts that were associated with stress response mechanisms, transportation, glycolysis and ethanol production in line with the biochemical environment of fermentations. The results of this thesis have serious practical implications for grapevine plant health (Chapter 2 and 3) and the wine making sector (Chapter 3, 4 and 5), while it offered benchmarking knowledge and diagnostic tools that could be further optimized and used in the vineyard management and the wine making process.

Η φυλλόσφαιρα και η καρπόσφαιρα του αμπελιού φιλοξενούν μικροβιακές κοινότητες των οποίων οι μηχανισμοί δόμησης επηρεάζονται τόσο από το το εξωτερικό περιβάλλον όσο και από το περιβάλλον του ίδιου του φυτού. Το επιφυτικό μικροβίωμα επηρεάζει σημαντικά την απόδοση και την υγεία του αμπελιού και επιπλέον τη διαδικασία οινοποίησης και την ποιότητα του τελικού οίνου. Η δομή και η σύνθεσή του μπορεί να ποικίλει ανάλογα με την επίδραση που ασκείται από τους παράγοντες που επικρατούν στον αμπελώνα, ανακλώντας αυτές τις επιρροές τόσο στην υγεία όσο και στη διαδικασία της οινοποίησης, Στη συγκεκριμένη διατριβή, στοχεύσαμε στο να διασαφηνίσουμε τους παράγοντες και τις συνθήκες που καθορίζουν τη σύσταση και του επιφυτικού (φυλλοσφαιρικού και καρποσφαιρικού) μικροβιώματος του αμπελιού και του μικροβιώματος του ξύλου στο αμπέλι, με το το τελευταίο να επικεντρώνεται περισσότερο στο ρόλο του μικροβιώματος όσον αφορά τις ασθένειες που προσβάλλουν τον κορμό του αμπελιού. Περαιτέρω, προσδιορίσαμε την επίδραση των παραγόντων που σχετίζονται με τον αμπελώνα και την οινοποίηση στη μικροβιακή διαδοχή κατά την οινοποίηση, υπό συνθήκες αυθόρμητης και ελεγχόμενης οινοποίησης, καθώς και την αντίστοιχη επίδρασή τους στο αντιοξειδωτικό, αντιμεταλλαξιγόνο και αντικαρκινικό προφίλ των παραγόμενων οίνων, διευκολύνοντας έτσι την εδραίωση συσχετίσεων μεταξύ του μικροβιώματος της οινοποίησης και των τελικών ιδιοτήτων των οίνων. Τέλος, μέσω αυθόρμητης και ελεγχόμενης οινοποίησης (μέσω amplicon sequencing) διερευνήσαμε τη μικροβιακή διαδοχή και τις μεταβολικές οδούς που χρησιμοποιεί η μικροβιακή κοινότητα της οινοποίησης για να ανταποκριθεί στις συνθήκες της ζύμωσης και να καταλήξει στην παραγωγή του οίνου (μέσω μετα-μεταγραφωματικής ανάλυσης).Αρχικά, εξετάσαμε το μικροβίωμα του ξύλου σε αμπέλια συμπτωματικά και μη συμπτωματικά σε ασθένειες κορμού του αμπελιού, σε τρεις κύριες ελληνικές ποικιλίες αμπέλου, καλλιεργημένες σε γεωγραφικά διαφορετικές ζώνες. Παρατηρήσαμε ότι ο παράγοντας της ποικιλίας/βιογεωγραφίας (ως συνδυασμένος παράγοντας) ήταν ο κύριος καθοριστικός και για τις μυκητιακές και για τις βακτηριακές μικροβιακές κοινότητες, ενώ ο παράγοντας της ασθένειας του κορμού διαφοροποίησε τα υγιή από τα ασθενή πρέμνα μόνο στην ποικιλία Ξινόμαυρο, δείχνοντας τη μεγαλύτερη ανθεκτικότητα της ποικιλίας αυτής ως προς τις συγκεκριμένες ασθένειες και κατ’ επέκταση τις πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις μεταξύ ποικιλίας και βιογεωγραφίας. Επιπροσθέτως, παρατηρήσαμε μια συσχέτιση βασιζόμενη στην ποικιλία των μικροοργανισμών P. chlamydospora, K. variispora, Fomitiporia spp και Diaporthe, που έχουν προταθεί ως αιτιολογικοί παράγοντες για τις ασθένειες κορμού του αμπελιού σε ασθενή πρέμνα, υποδηλώνοντας την άμεση εμπλοκή τους στην εδραίωση αυτών των ασθενειών. Μέσω της ανάλυσης με τον αλγόριθμό Random Forest, εντοπίσαμε τους μικροοργανισμούς P. chlamydospora, K. Variispora, μαζί με τους Cladosporium spp. και A. alternata ως πρώιμους προγνωστικούς παράγοντες των ασθενειών κορμού του πρέμνου, διαθέτοντάς τους ως ένα χρήσιμο μικροβιακό εργαλείο ανάλυσης για την πρώιμη ταυτοποίηση αυτών των ασθενειών κορμού του αμπελιού. Όσον αφορά το βακτηριακό μικροβίωμα, η αξιοσημείωτη αρνητική συνεμφάνιση, σε υγιή πρέμνα, των Bacillus και Streptomyces με μικροβιακά στελέχη των Phaemoniella, Phaeoacremonium και Seimatosporium, με τα τρία τελευταία να αποτελούν μέλη του παθοβιώματος των ασθενειών κορμού του αμπελιού, υποδηλώνει την πιθανή κατασταλτική τους δράση ως προς τις ασθένειες κορμού του αμπελιού, που ωστόσο πρέπει να διερευνηθεί περεταίρω, μέσω στοχευμένης απομόνωσης και χαρακτηρισμού αυτού του κατασταλτικού δυναμικού τους, in vitro αλλά και σε φυτά.Κατά δεύτερον, αναλύσαμε μέσω amplicon sequencing το επιφυτικό μικροβίωμα του αμπελιού (σε καρπόσφαιρα και φυλλόσφαιρα), από τέσσερις ελληνικές εμβληματικές ποικιλίες αμπελιού, προερχόμενες από διαφορετικές γεωγραφικές κλίμακες, στοχεύοντας στο να προσδιορίσουμε τις επιδράσεις των διαφορετικών δομικών παραγόντων στη σύνθεση του μικροβιώματος του αμπελιού. Εξετάζοντας σε ευρεία γεωγραφική κλίμακα, κατά μήκος διαφορετικών βιογεωγραφικών περιοχών, η βιογεωγραφία αποτέλεσε τον κύριο καθοριστικό παράγοντα στον σχηματισμού των επιφυτικών μυκητιακών και βακτηριακών μικροβιακών κοινοτήτων. Ωστόσο, σε επίπεδο τοπικής κλίμακας, εντός της αμπελουργικής περιοχής της Αιγιάλειας, κύριος καθοριστικός παράγοντας γίνεται η ποικιλία. Πραγματοποιώντας την ανάλυση ξεχωριστά για καθεμιά από τις δυο ποικιλίες στην περιοχή της Αιγιάλειας (Ροδίτη και Σιδερίτη), οι επιδράσεις του terroir γίνονται εμφανείς. Επιπροσθέτως, η επιφυτική μυκητιακή μικροβιακή κοινότητα του αμπελιού ανταποκρίθηκε ισχυρότερα ως προς τους δομικούς παράγοντες που μελετήθηκαν, με πιο ξεκάθαρα μοτίβα και στις δύο κλίμακες που εξετάστηκαν , σε αντίθεση με τη βακτηριακή επιφυτική κοινότητα που έδειξε ασθενέστερη ανταπόκριση στους προς μελέτη παράγοντες, με ασθενέστερα μοτίβα σύνθεσης.Τρίτον, επεκτείναμε τη μελέτη μας στο να διερευνήσουμε τις επιδράσεις των παραγόντων που σχετίζονται με τον αμπελώνα στο μικροβίωμα της οινοποίησης, υπό διαφορετικούς τύπους οινοποίησης κατά τις εφαρμοζόμενες οινοποιητικές πρακτικές. Δείξαμε ότι, υπό τις τρέχουσες ρεαλιστικές πρακτικές της οινοποιητικής διαδικασίας, παράγοντες που σχετίζονται με τον αμπελώνα, όπως η ποικιλία και το έτος συγκομιδής, παραμένουν ενεργοί κατά τη διαδικασία της οινοποίησης, ενώ η επίδραση του terroir, παρ’ ότι σημαντική αρχικά (στο στάδιο του αμπελώνα και στα αρχικά στάδια της οινοποίησης), γίνεται όλο και λιγότερο αισθητή κατά τη διεξαγωγή και εξέλιξη της οινοποίησης. Η στρατηγική οινοποίησης που ακολουθήθηκε επηρέασε εξίσου σημαντικά το μικροβίωμα της οινοποίησης, με την επίδραση αυτή να ποικίλει μεταξύ μυκήτων και βακτηρίων. Η μυκητιακή μικροβιακή κοινότητα παρουσίασε ένα κοινό γενικά μοτίβο από ζύμες που δεν αποτελούν στελέχη σακχαρομύκητα και νηματώδεις μύκητες να κυριαρχούν στα αρχικά στάδια της οινοποίησης, που αντικαταστάθηκε όμως από αυτόχθονα ή εμβολιασμένα στελέχη σακχαρομύκητα κατά την εξέλιξη της ζύμωσης. Από την άλλη πλευρά, η μικροβιακή διαδοχή της βακτηριακής κοινότητας διέφερε, με το πιο κοινό μοτίβο που ακολουθήθηκε να απαρτίζεται από μια αρχικά βακτηριακή κοινότητα πλούσια σε βακτήρια οξικού οξέως, που αντικαταστάθηκε όμως από στελέχη του Oenococcus στο τέλος της ζύμωσης. Το έτος συγκομιδής και ο τύπος οινοποίησης αποτέλεσαν επίσης σημαντικούς παράγοντες καθορισμού του αντιοξειδωτικού, αντιμεταλλαξιγόνου και αντικαρκινικού προφίλ των παραγόμενων οίνων. Η περεταίρω ανάλυση, εντόπισε σημαντικές και κοινές μεταξύ των ποικιλιών θετικές συσχετίσεις μελών της μικροβιακής κοινότητας, όπως οι ζύμες-μη σακχαρομύκητα Torulaspora delbrueckii και Lachancea quebecensis με τις αντικαρκινικές και αντιοξειδωτικές ιδιότητες των οίνων. Τα ευρήματα αυτά θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν περεταίρω μέσω μιας μικροβιακά μεσολαβούμενης οινοποιητικής διαδικασίας, που θα οδηγούσε στην παραγωγή οίνων υψηλής ποιότητας, με επιθυμητές ιδιότητες και ενισχυμένη τοπική ταυτότητα. Τέλος, με σταφύλια της ελληνικής ποικιλίας Βιδιανό, αξιολογήσαμε σε αυθόρμητη και εμπορική ζύμωση (και οι δύο με την παρέμβαση συντηρητικών), τη σύνθεση και τη μικροβιακή διαδοχή του μυκητιακού και βακτηριακού μικροβιώματος και διερευνήσαμε, μέσω μέτα-μεταγραφωματικής ανάλυσης, τις μεταβολικές οδούς και τις λειτουργίες που ακολουθεί το μικροβίωμα της οινοποίησης, κατά τη διεξαγωγή της ζύμωσης. Το στάδιο οινοποίησης αναγνωρίστηκε ως ο σημαντικότερος δομικός παράγοντας του μικροβιώματος της οινοποίησης, ενώ και ο τύπος οινοποίησης που ακολουθήθηκε συνέβαλε, αλλά σε μικρότερο βαθμό, πιθανότατα ως αποτέλεσμα της κοινής χρήσης συντηρητικών και στις δύο οινοποιήσεις. Η κοινότητα των μυκήτων παρουσίασε ευρεία φυλογενετική ποικιλομορφία από ζύμες-μη σακχαρομύκητες στα αρχικά στάδια ζύμωσης, που αντικαταστάθηκε από την πλήρη κυριαρχία στελεχών σακχαρομύκητα, εμβολιασμένων ή γηγενών, καθώς η ζύμωση εξελισσόταν. Η βακτηριακή κοινότητα αποτελούνταν από βακτήρια γαλακτικού και οξικού οξέος, με στελέχη του Oenococcus να παρουσιάζουν προοδευτική αύξηση κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. Η μετα-μεταγραφωματική ανάλυση ενίσχυσε την ισχυρή επίδραση του σταδίου οινοποίησης στη μεταβολική δραστηριότητα του μικροβιώματος της οινοποίησης. Όταν αναλύθηκαν ξεχωριστά τα δεδομένα για το κάθε στάδιο οινοποίησης, παρατηρήσαμε ισχυρές επιδράσεις του τύπου οινοποίησης που ακολουθήθηκε (αυθόρμητη και ελεγχόμενη) στην αρχή και τη μέση της ζύμωσης. Συνολικά, παρατηρήσαμε μια γονιδιακή έκφραση επαγόμενη από στελέχη του σακχαρομύκητα και άλλες ζύμες, που συσχετίστηκαν με μηχανισμούς απόκρισης σε συνθήκες στρες, στη μεταφορά, τη γλυκόλυση και την παραγωγή αιθανόλης, σε συμφωνία με το βιοχημικό περιβάλλον των ζυμώσεων. Τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης διατριβής εμπλέκονται σημαντικά στην υγεία των φυτών του αμπελιού (Κεφάλαια 2 και 3) και στον τομέα της παραγωγής οίνου (Κεφάλαια 3, 4 και 5), ενώ προσφέρουν σημαντικές γνώσεις και διαγνωστικά εργαλεία που μπορούν να βελτιστοποιηθούν περαιτέρω και να χρησιμοποιηθούν στη διαχείριση του αμπελώνα και τη διαδικασία παραγωγής οίνου.