Η δομική βάση αναγνώρισης υδατανθράκων από ανθρώπινες γαλεκτίνες

Abstract

Galectins are involved in many biological processes, generally functioning by interacting with various cell surface glycoconjugates, targeting β-galactoside epitopes. The β-galactoside binding feature is attributed to the evolutionally conserved carbohydrate recognition domain (CRD) where the glycan binding takes place. Currently, 16 galectins have been found in mammals out of which 12 are expressed in humans. Human galectins can be divided into three subgroups according to their CRD distribution: the prototype galectins, which contain one CRD (galectins 1, 2, 7, 10, 13, 14, and 16), the tandem-repeat galectins which consist of two CRDs (galectins 4, 8, 9 and 12) and the chimera-type galectins (galectin-3). The only member of chimeric galectins has a single CRD at the C-terminus and a short non-lectin peptide motif at the N-terminus. Its CRD consists of 130-140 residues which fold into two antiparallel β-sheets of 6 (S1-S6) and 5 β-strands (F1- F5), respectively. Galectins have a role in many pathophysiological processes such as cardiovascular diseases, cancer development and progression, autoimmune diseases, and metabolic disorders. The unique chimera-type galectin-3 is one of the most well-studied members of this family. Galectin-3 is involved in a plethora of diseases, with emphasis on those associated with chronic inflammation, and it is currently a validated pharmaceutical target. Pharmaceutical industry is employing various strategies, for the design and development of potent synthetic small molecule antagonists or large biologics from natural sources to target galectin-3 for therapeutic intervention. The most potent antagonists thus far, are thiodigalactoside derivatives carrying aryl-triazolyl moieties attached to C-3 of both galactose units with affinities for galectin-3 in the low nanomolar range. One compound of this class, GB0139, is currently in phase 2b clinical trials against lung fibrosis (NCT03832946). Acknowledging the potential of galectin-3 for the development of potent drugs, we studied the binding of 46 compounds to galectin-3 by X-ray crystallography and ITC. We studied two groups of compounds. The first group were thiodisaccharides, where the two sugar rings are linked via sulfur by 1→2 bonds instead of 1→1 which was present in the thiodigalactosides studied thus far. The second group were compounds that had a β-D-galactopyranoside core decorated with various substituents such as phenyl, pyrimidine, triazole, tetrazole and carbonyl groups. Due to the high conservation of galectins’ CRD their binding mode was also studied in galectins 7, 8N and 10. The best antagonist of the first group displayed a KD value of 8 μM for galectin-3. Analysis of the thermodynamic binding parameters revealed that the binding Gibbs free energy (ΔG) of the compounds in the first group was dominated by enthalpy (ΔH). The structural mode of binding of 1,2-thiodisaccharides to galectin-3 was studied by X-ray crystallography that uncovered the unique role of water-mediated hydrogen bonds in conferring enthalpy-driven affinity enhancement for the new antagonists. This 1,2-thiodisaccharide-type scaffold represents a new lead for galectin-3 inhibitor discovery and offers several possibilities for further development. From 41 compounds in the second group, 14 antagonists were found to be more selective for galectin-3, over galectins 7, 8N, and 10. These antagonists can serve as lead compounds for the development of selective galectin-3 compounds, providing new perspectives for the therapeutic intervention of various diseases. In parallel, we determined the structural mode of binding of a potent antagonist (KD = 2.4 μM) of galectin-7 to highlight the structural elements that confer selectivity for this galectin.

Η οικογένεια των λεκτινών περιλαμβάνει ένα μεγάλο εύρος πρωτεϊνών που προσδένουν επιλεκτικά υδατάνθρακες των γλυκοπρωτεϊνών της κυτταρικής επιφάνειας. Στην οικογένεια αυτή ανήκουν οι γαλεκτίνες. Oι γαλεκτίνες εμπλέκονται σε μια πληθώρα βιολογικών διεργασιών μέσω της πρόσδεσής τους σε γλυκοσυζεύγματα της κυτταρικής επιφάνειας, αναγνωρίζοντας τους β-γαλακτοζιδικούς επίτοπους. Ένα κοινό χαρακτηριστικό τους αποτελεί η ύπαρξη τουλάχιστον μιας καλά συντηρημένης επικράτειας αναγνώρισης υδατανθράκων (Carbohydrate Recognition Domain, CRD). Μέχρι σήμερα 16 γαλεκτίνες έχουν βρεθεί στα θηλαστικά ενώ οι 12 εκφράζονται και στον άνθρωπο. Οι ανθρώπινες γαλεκτίνες μπορούν να κατηγοριοποιηθούν με βάση την οργάνωση των CRDs σε τρεις ομάδες: τις πρωτότυπες γαλεκτίνες, οι οποίες περιέχουν μια CRD και σε αυτή την ομάδα ανήκουν οι γαλεκτίνες 1, 2, 7, 10, 13, 14 και 16, τις χιμαιρικού τύπου γαλεκτίνες που η CRD είναι συνδεδεμένη με μια επικράτεια που δεν είναι χαρακτηριστική της οικογένειας των λεκτινών και σε αυτή την ομάδα ανήκει η γαλεκτίνη-3 και στις επαναλαμβανόμενες τύπου γαλεκτίνες οι οποίες αποτελούνται από δύο CRDs και στην ομάδα αυτή ανήκουν οι γαλεκτίνες 4, 8, 9 και 12. Η CRD αποτελείται από 130-140 κατάλοιπα που σχηματίζουν μία σφαιρική δομή που είναι υπεύθυνη για τη σύνδεση των σακχαριτών. Το μοτίβο αναδίπλωσης της περιοχής αυτής αποτελείται από δύο αντιπαράλληλα β-πτυχωτά φύλλα που συγκροτούνται από 6 β-κλώνους που δημιουργούν την κοίλη πλευρά (S1-S6) και 5 β-κλώνους που δημιουργούν την κυρτή πλευρά (F1- F5). Η πρωτοταγής δομή των CRDs των ανθρώπινων γαλεκτινών είναι αρκετά συντηρημένη (20-50%). Εμπλέκονται σε πολλές παθολογικές καταστάσεις, όπως είναι οι καρδιαγγειακές παθήσεις, η ανάπτυξη και η εξέλιξη του καρκίνου, αυτοάνοσα νοσήματα και μεταβολικές διαταραχές. Λόγω των σημαντικών τους ρόλων, οι γαλεκτίνες θεωρούνται ως πρωτεΐνες στόχοι για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Η μοναδική χιμαιρικού τύπου γαλεκτίνη-3 αποτελεί μία από τις πιο μελετημένες πρωτεΐνες της οικογένειας. Εμπλέκεται σε πολλές παθοφυσιολογικές καταστάσεις και γίνονται πολλές προσπάθειες για την ανάπτυξη ενώσεων που θα προσδένονται ειδικά και θα μπορούσαν να αποτελέσουν εν δυνάμει φάρμακα. Μέχρι σήμερα, έχουν πραγματοποιηθεί περίπου 31 κλινικές μελέτες, οι οποίες μελετούν την επίδραση των ενώσεων που προσδένονται στη γαλεκτίνη-3 στην ανάπτυξη καρκινικών όγκων, στην οστεοαρθρίτιδα, στην πνευμονική ίνωση καθώς και στη νόσο COVID-19. Οι ενώσεις αυτές είναι συνθετικές μικρού και μεγάλου μοριακού βάρους, μονοκλωνικά αντισώματα και φυσικά πολυμερή όπως οι πηκτίνες. Οι πιο ειδικοί και με υψηλή συγγένεια ανταγωνιστές ως προς τη γαλεκτίνη-3 που έχουν βρεθεί μέχρι σήμερα, είναι ανάλογα θειοδιγαλακτόζης που φέρουν υποκαταστάτες αρυλ-τριαζόλης στον C3 και των δύο μορίων της γαλακτόζης, και εμφανίζουν τιμές KD της τάξεως των nM. Μία τέτοια ένωση αποτελεί η GB0139, η οποία βρίσκεται σε φάση κλινικών μελετών 2b για τη θεραπεία της πνευμονικής ίνωσης. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν 46 ενώσεις, με κρυσταλλογραφία ακτινών-Χ και θερμιδομετρία ισοθερμικής τιτλοδότησης (ITC), με στόχο την εύρεση ενώσεων-οδηγών για την περαιτέρω ανάπτυξη ανταγωνιστών, που θα εμφανίζουν υψηλή εξειδίκευση και συγγένεια ως προς τη γαλεκτίνη-3. Μιας και οι πλέον ισχυροί ανταγωνιστές που έχουν βρεθεί για την γαλεκτίνη-3 μέχρι σήμερα ήταν παράγωγα θειοδιγαλακτοζιτών όπου τα δύο σάκχαρα συνδέονται μέσω θείου με 1→1 δεσμούς, η πρώτη ομάδα ενώσεων που μελετήθηκε είναι θειοδισακχαρίτες, στις οποίες τα δύο σάκχαρα συνδέονται μεταξύ τους μέσω θείου με 1→2 δεσμούς. Η δεύτερη συλλογή ενώσεων που μελετήθηκε περιλάμβανε ενώσεις που έχουν ένα κοινό κορμό β-D-γαλακτοπυρανοζίτη και φέρουν υποκαταστάτες, φαινυλίου, πυριμιδίνης, τριαζόλης, τετραζόλης και καρβονυλίων. Λόγω της υψηλής συντήρησης της CRD στην οικογένεια των λεκτινών η πρόσδεση των παραπάνω ενώσεων μελετήθηκε και στις γαλεκτίνες-7, 8Ν και 10, με στόχο τη διερεύνηση της εξειδίκευσης τους. Από την πρώτη ομάδα ενώσεων, 13, 14, 15, και 17, βρέθηκε πως ο καλύτερος ανταγωνιστής ήταν ο 14 που εμφάνισε KD 8 μΜ για τη γαλεκτίνη-3. Ανάλυση των παραμέτρων θερμοδυναμικής δέσμευσης των ανταγωνιστών στη γαλεκτίνη-3, αποκάλυψε ότι η ελεύθερη ενέργεια πρόσδεσης Gibbs (ΔG) τους κυριαρχείται από μεταβολές στην ενθαλπία (ΔΗ). Ο δομικός τρόπος σύνδεσης των 1,2-θειοδισακχαριτών στη γαλεκτίνη-3 μελετήθηκε με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ αποκαλύπτοντας το μοναδικό ρόλο των διαμεσολαβούμενων από μόρια ύδατος αλληλεπιδράσεων δεσμών υδρογόνου στην ενίσχυση της πρόσδεσης μέσω ενίσχυσης της ενθαλπίας. Αυτό το ικρίωμα, 1,2-θειοδισακχαρίτη μπορεί να αποτελέσει μια νέα ένωση-οδηγό για την ανακάλυψη ανταγωνιστών της γαλεκτίνης-3. Από τη δεύτερη ομάδα, 41 ενώσεων, βρέθηκε πως οι LL80, HA087, HA088, KS782, HL210-2, KISZ322, KISZ340, KISZ333IAB, KM191, KM192, HL233, HL241, HL247 και ΗL248, εμφανίζουν επιλεκτικότητα για τη γαλεκτίνη-3, έναντι των γαλεκτινών-7, 8Ν και 10. Ανάλογα με τη σταθερά σύνδεσης τους, με βάση τον δομικό τρόπο πρόσδεσης τους στη γαλεκτίνη-3, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως νέες ενώσεις-οδηγοί για την ανάπτυξη εκλεκτικών ανταγωνιστών της γαλεκτίνης-3, παρέχοντας νέες προοπτικές για τη θεραπευτική προσέγγιση πληθώρας ασθενειών. Τέλος, μελετήθηκε ο δομικός τρόπος πρόσδεσης της ένωσης HMOB11-1 στη γαλεκτίνη-7. Η ένωση αυτή εμφανίζει υψηλή συγγένεια πρόσδεσης (KD = 2,4 μΜ), και σήμερα πραγματοποιούνται μελέτες ex vivo για την εύρεση της αποτελεσματικότητας της στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών.