Σχεδιασμός, σύνθεση και αποτίμηση της βιολογικής δράσης νέων ετεροκυκλικών ενώσεων που επάγουν τη δράση της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης

Abstract

Soluble guanylyl cyclase (sGC) is a heterodimeric enzyme that catalyzes the conversion of GTP to cGMP upon binding of endogenously produced NO to a prosthetic heme moiety, located in the regulatory β1 Heme-NO OXygen (H-NOX) domain. Diminished NO bioavailability or impaired sGC sensitivity to the endogenous ligand due to loss of the heme moiety in oxidative stress conditions, could lead to dysregulation of NO/sCG/cGMP signaling axis. The consequences of this have best been described regarding the cardiovascular system, where it contributes to dysfunction of vascular smooth muscle and endothelial cells, ultimately leading to hypertension, inflammation, heart hypertrophy and heart failure. In addition, this axis maintains homeostasis in other systems and its dysregulation can lead to e.g. fibrosis in multiple organs or altered metabolic (adipose) function. During the last decades, two classes of novel pharmacological agents have been developed for the treatment of these diseases, sGC stimulators and activators, aiming to restore or augment enzymatic activity of the NO-insensitive forms of sGC in a heme-dependent or heme-independent manner, respectively. The present study focused on the discovery of new chemical entities which can act as sGC agonists. In particular, several rational drug design approaches, such as docking studies and analysis of previously reported structure-activity relationship studies of known sGC agonists, were applied for the targeted design of novel sGC agonists. Based on the obtained findings, new heterocycles, such as 3,4-dihydroquinoxalinone and pyrazolo[3,4-c]pyridone derivatives, were designed as potential sGC activators and stimulators, respectively. Subsequently, the synthesis of the designed molecules was thoroughly investigated. The synthesis of the new compounds was accomplished through an efficient synthetic plan which involved the construction of the heterocyclic skeletons using appropriate precursors and the introduction of desirable substituents at specific positions of these heterocyclic cores. Finally, a preliminary biological evaluation of selected, newly synthesized 3,4-dihydroquinoxalinone and pyrazolo[3,4-c]pyridone derivatives was conducted in in vitro biological assays concerning their ability to induce the enzymatic activity of sGC. Although the tested 3,4-dihydroquinoxalinone derivatives did not provoke any significant increase of cGMP levels during cell-based assessment, further studies of these compounds on purified recombinant sGC revealed activation of the enzyme, even after loss of heme. Furthermore, selected pyrazolo[3,4-c]pyridone derivatives exhibited sGC stimulating activity by potentiating the effect of NO on A7r5 smooth muscle and HUVEC endothelial cells and, consequently, promoting anti-proliferative and anti-inflammatory activities on these cell models and contributing to an overall vascular protective function.

Η διαλυτή γουανυλική κυκλάση (sGC) είναι ένα ετεροδιμερές ένζυμο που καταλύει τη μετατροπή του GTP σε cGMP κατόπιν δέσμευσης του ενδογενούς ΝΟ σε μία ομάδα αίμης της ρυθμιστικής β1 H-NOX περιοχής. Μείωση είτε της βιοδιαθεσιμότητας του ΝΟ είτε της ευαισθησίας της sGC για τον ενδογενή προσδέτη λόγω απώλειας της αίμης σε συνθήκες οξειδωτικού στρες, μπορεί να οδηγήσει σε απορρύθμιση του NO/sCG/cGMP σηματοδοτικού άξονα. Η διαταραχή αυτή συσχετίζεται με ενδοθηλιακή δυσλειτουργία και κατ’ επέκταση με την εκδήλωση πολυάριθμων καρδιαγγειακών, νεφρικών και πνευμονικών παθήσεων. Για την αντιμετώπιση αυτών αναπτύχθηκαν τα τελευταία χρόνια δύο κατηγορίες θεραπευτικών παραγόντων, οι διεγέρτες και οι ενεργοποιητές της sGC, που επάγουν τη δράση της απευαισθητοποιημένης για το ΝΟ sGC μέσω ενός αιμο-εξαρτώμενου ή αιμο-ανεξάρτητου μηχανισμού, αντίστοιχα. Η παρούσα μελέτη εστίασε στην ανακάλυψη νέων χημικών οντοτήτων με αγωνιστική δράση έναντι της sGC. Συγκεκριμένα, για τον στοχευμένο σχεδιασμό επιστρατεύτηκαν μεθοδολογίες ορθολογικού σχεδιασμού, όπως υπολογιστικές μελέτες μοριακής προσομοίωσης πρόσδεσης καθώς και αναλύσεις σχέσεων χημικής δομής-βιολογικής δραστικότητας γνωστών αγωνιστών της sGC. Τα δεδομένα που προέκυψαν αξιοποιήθηκαν για τον σχεδιασμό νέων υποψήφιων αγωνιστών της sGC. Συγκεκριμένα, σχεδιάσθηκαν παράγωγα που έφεραν κατάλληλα υποκατεστημένο 3,4-διϋδροκινοξαλινονικό και πυραζολο[3,4-c]πυριδονικό σκελετό, ως νέοι υποψήφιοι ενεργοποιητές και διεγέρτες της sGC, αντίστοιχα. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε εκτενής διερεύνηση για την αποδοτική σύνθεση των επιθυμητών παραγώγων που προέκυψαν κατά τον μοριακό σχεδιασμό. Η σύνθεση των νέων ενώσεων επιτεύχθηκε μέσω συνθετικών οδών που περιλάμβαναν κατά κανόνα την ανοικοδόμηση των βασικών ετεροκυκλικών σκελετών από κατάλληλες πρόδρομες ενώσεις και ακολούθως την εισαγωγή των επιθυμητών υποκαταστατών σε συγκεκριμένες θέσεις των ετεροκυκλικών πυρήνων. Τέλος, επιλεγμένος αριθμός 3,4-διϋδροκινοξαλινονικών και πυραζολο[3,4-c]πυριδονικών παραγώγων μελετήθηκε σε in vitro βιολογικές δοκιμασίες ως προς την ικανότητά τους να επάγουν τη δράση της sGC. Αν και τα υπό μελέτη 3,4-διϋδροκινοξαλινονικά παράγωγα δεν προκάλεσαν αύξηση των επιπέδων του cGMP σε κυτταρικούς πληθυσμούς που εκφράζουν την sGC, εμφάνισαν sGC ενεργοποιητική δράση κατά τη λειτουργική τους αξιολόγηση στο απομονωμένο ένζυμο. Επιπλέον, επιλεγμένα πυραζολο[3,4-c]πυριδονικά παράγωγα εμφάνισαν sGC διεγερτική δράση, αφού η επίδραση τους σε A7r5 λεία μυϊκά και HUVEC ενδοθηλιακά κύτταρα προκάλεσε ενίσχυση της δράσης του ΝΟ, συνεισφέροντας με αυτό τον τρόπο σε ευεργετικές λειτουργίες του αγγειακού ενδοθηλίου, όπως η αναστολή πολλαπλασιασμού των λείων μυϊκών κυττάρων και η μείωση σχηματισμού φλεγμονής.