Μελέτη συζευγμάτων σακχαριτών με πεπτίδια

Abstract

Multiple Sclerosis (MS) is a chronic, inflammatory, immunologically controlled disease of the Central Nervous System (CNS) characterized by destruction of myelin. Myelin is a highly specialized, compact multi-layered membrane that wraps around the axons of neurons forming the myelin sheath and helping the rapid transmission of nerve impulses. Studies have shown that Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG), although a minor component of myelin, is an important autoantigen in the development of MS and Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), the experimental animal model for demyelinating diseases. In particular, the epitope 35-55 of the MOG protein is the dominant antigen that causes the appearance of EAE in experimental animals and is the target of immune responses in MS, inducing the production of highly specific antibodies. Developing peptide conjugates with sugars to target cells of the immune system is a common technique. Mannan (polymannose, from the yeast Saccharomyces Cerevisiae) is widely used for the transfer of proteins and peptides to the surface of antigen-presenting cells, since it targets the mannose receptor of these cells. Studies have shown that the 35-55 epitope of the MOG protein conjugated to the polysaccharide mannan in its oxidized form, via a [Lys-Gly]5 bridge, can modify the immune response of EAE and protect mice from its development. For this reason, the study of the conjugate and the chemical characteristics of the coupling reaction as well as the finding of a suitable method for the identification of the MOG35-55 peptide conjugated with the polysaccharide mannan, the investigation of the possible modifications of the peptide during the synthesis of the conjugate as well as the study of the stability of the synthesized conjugates, are important objectives, which were developed in the present doctoral thesis. The study of these conjugates was held in two ways. The first approach concerns the study of this conjugate and its components with Nuclear Magnetic Resonance (NMR) in one (1H, 13C) and two dimensions (2D COSY, 2D ROESY, 2D TOCSY, 2D HSQC and 2D HMBC). For this purpose, samples of mannose, mannan, oxidized mannan and conjugate of oxidized mannan with the peptide analogue [KG]5MOG35-55 were studied. Through the NMR study, i) analysis of the structure of the mentioned samples, ii) control of the formation of aldehyde groups during the oxidative cleavage reaction of the polysaccharide, iii) calculation of the oxidation rate and iv) control of the formation of Schiff bases in the conjugate, were studied. The second approach concerns the development of a methodology to study the stability of the synthesized conjugates and to monitor possible modifications they may undergo. For this purpose, a competitive ELISA methodology based on the [KG]5MOG35-55 epitope was developed and polyclonal antibodies against MOG36-55 were produced (by Davids Biotechnologies) by immunization of rabbits. The method was checked for its accuracy and reproducibility, but also for the possibility of false reactivity with molecules other than the antigen, followed by the study of the stability of the conjugate during storage. In addition, through the ELISA methodology, possible modifications of the conjugate were monitored. These modifications concern conversions that may occur in the epitope a) either during conjugation with mannan at basic pH 9,0, such as the deamidation of Asn to Asp and iso-Asp, b) or during peptide synthesis with Fmoc/tBu methodology, where under the acidic conditions during treatment with TFA, methionine can be oxidized to the corresponding sulfoxide, c) either in vivo, as for example the conversion of Arg residues to Cit by the action of PAD enzymes or the proteolytic cleavage of the protein by the enzyme trypsin. For this purpose, the following peptides were synthesized in solid phase, step by step, with the Fmoc/tBu methodology on 2-chlorotrityl chloride resin (ClTR-Cl): i) [KG]5MOG35-55 (Asp53); ii) [KG]5MOG35-55 (isoAsp53); iii) [KG]5MOG35-55 (Met(O)35); iv) [KG]5MOG35-55 (Cit41, 46, 52) and v) [KG]5MOG35-46. These peptides were then purified using semi-preparative RP-HPLC and identified via ESI-MS spectrometry, coupled to oxidized mannan and studied via ELISA methodology.

Η Σκλήρυνση κατά Πλάκας (ΣΚΠ) είναι μια χρόνια, φλεγμονώδης, ανοσολογικά ελεγχόμενη νόσος του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) η οποία χαρακτηρίζεται από καταστροφή της μυελίνης. Η μυελίνη είναι μια εξαιρετικά εξειδικευμένη, συμπαγής πολυστρωματική μεμβράνη, η οποία τυλίγεται γύρω από τους άξονες των νευρόνων σχηματίζοντας το έλυτρο μυελίνης και βοηθώντας στη γρήγορη μετάδοση των νευρικών ερεθισμάτων. Μελέτες έχουν δείξει ότι η μυελινική γλυκοπρωτεΐνη των ολιγοδενδριτών (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein, MOG), παρότι αποτελεί δευτερεύον συστατικό της μυελίνης, αποτελεί σημαντικό αυτοαντιγόνο στην εμφάνιση της ΣΚΠ και της Πειραματικής Αυτοάνοσης Εγκεφαλομυελίτιδας (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE), το ζωικό πειραματικό μοντέλο για τις απομυελινωτικές νόσους. Συγκεκριμένα, ο επίτοπος 35-55 της MOG πρωτεΐνης είναι το κυρίαρχο αντιγόνο το οποίο προκαλεί της εμφάνιση της ΕΑΕ στα πειραματόζωα και αποτελεί στόχο ανoσολογικών αποκρίσεων στη ΣΚΠ, επάγοντας την παραγωγή ειδικών αντισωμάτων.Η ανάπτυξη συζευγμάτων πεπτιδίων με σάκχαρα με σκοπό να στοχεύσουν κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος είναι μία συνηθισμένη τεχνική στην ανάπτυξη νέων καινοτόμων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Η μαννάνη (πολυμανόζη, από τη ζύμη Saccharomyces Cerevisiae), χρησιμοποιείται ευρέως για τη μεταφορά πρωτεϊνών και πεπτιδίων στην επιφάνεια αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων, αφού στοχεύει τον υποδοχέα μανόζης των κυττάρων αυτών. Μελέτες έχουν δείξει ότι ο επίτοπος 35-55 της MOG πρωτεΐνης συζευγμένος με τον πολυσακχαρίτη μαννάνη στην οξειδωμένη του μορφή, μέσω μιας γέφυρας [Lys-Gly]5, μπορεί να τροποποιήσει την ανοσολογική απόκριση της ΕΑΕ και να προστατεύσει τα ποντίκια από την εμφάνιση συμπτωμάτων της νόσου. Η ενδελεχής μελέτη του εν λόγω συζεύγματος και των χημικών χαρακτηριστικών της αντίδρασης σύζευξης καθώς επίσης και η εύρεση μίας κατάλληλης μεθόδου για την αναγνώριση του MOG35-55 πεπτιδίου συζευγμένο με τον πολυσακχαρίτη μαννάνη που θα χρησιμοποιηθεί για τη διερεύνηση των πιθανών τροποποιήσεων του πεπτιδίου κατά τη δημιουργία του συζεύγματος καθώς και για τη μελέτη της σταθερότητας των συντεθειμένων συζευγμάτων, αποτελούν σημαντικούς στόχους, οι οποίοι αναπτύχθηκαν στη παρούσα διδακτορική διατριβή. Η μελέτη των συζευγμάτων έγινε με δύο τρόπους. Η πρώτη προσέγγιση αφορά τη μελέτη του συζεύγματος αυτού και των συστατικών του με ΠυρηνικόΜαγνητικό Συντονισμό (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) μίας (1H, 13C) και δύο διαστάσεων (2DCOSY, 2D ROESY, 2D TOCSY, 2D HSQC και 2D HMBC). Για τον σκοπό αυτό μελετήθηκαν δείγματα μανόζης, μαννάνης, οξειδωμένης μαννάνης και συζεύγματος οξειδωμένης μαννάνης με το πεπτιδικό ανάλογο [KG]5MOG35-55. Μέσω της μελέτης NMR πραγματοποιήθηκε: i) η ανάλυση της δομής των δειγμάτων που αναφέρθηκαν, ii) ο έλεγχος του σχηματισμού αλδεϋδομάδων κατά την αντίδραση οξειδωτικής διάσπασης του πολυσακχαρίτη, iii) ο υπολογισμός του ποσοστού οξείδωσης και iv) ο έλεγχος του σχηματισμού βάσεων Schiff στο σύζευγμα. Η δεύτερη προσέγγιση αφορά την ανάπτυξη αναλυτικής μεθοδολογίας για τη μελέτη της σταθερότητας των συντεθειμένων συζευγμάτων και για την παρακολούθηση πιθανών τροποποιήσεων που δύναται να υποστούν. Για τον σκοπό αυτό αναπτύχθηκε μεθοδολογία ανταγωνιστικής ELISA με βάση τον επίτοπο [KG]5MOG35-55 και παράχθηκαν (από την Davids Biotechnologies) πολυκλωνικά αντισώματα κατά του MOG36-55 μέσω ανοσοποίησης κουνελιών. Η μέθοδος ελέγχθηκε ως προς την ακρίβεια και την επαναληψιμότητά της, αλλά και ως προς την πιθανότητα λανθασμένης δραστικότητάς της με μόρια διαφορετικά του αντιγόνου. Ακολούθησε η μελέτη της σταθερότητας του συζεύγματος κατά την αποθήκευση του. Επιπλέον μέσω της μεθοδολογίας ELISA έγινε παρακολούθηση πιθανών τροποποιήσεων τους συζεύγματος. Οι τροποποιήσεις αυτές αφορούν μετατροπές οι οποίες μπορούν να συμβούν στον επίτοπο α) είτε κατά τη σύζευξη με τη μαννάνη σε βασικό pH 9,0, όπως η απαμίδωση της Asn σε Asp και iso-Asp, β) είτε κατά την πεπτιδική σύνθεση με την Fmoc/tBu μεθοδολογία, όπου υπό τις όξινες συνθήκες κατά την επεξεργασία με TFA, η μεθειονίνη μπορεί να οξειδωθεί στο αντίστοιχο σουλφοξείδιο, γ) είτε in vivo, όπως για παράδειγμα η μετατροπή των καταλοίπων Arg σε Cit από τη δράση των ενζύμων PAD(Peptidylarginine Deiminase enzymes) ή η πρωτεολυτική διάσπαση της πρωτεΐνης από το ένζυμο θρυψίνη. Για τον σκοπό αυτό συντέθηκαν σε στερεή φάση, με την Fmoc/tBu μεθοδολογία επί της 2-χλωροτριτυλοχλωριδίου ρητίνης (ClTR-Cl) τα ανάλογα: i) [KG]5MOG35-55 (Asp53); ii) [KG]5MOG35-55 (isoAsp53); iii) [KG]5MOG35-55 (Met(O)35); iv) [KG]5MOG35-55 (Cit41, 46, 52) και v) [KG]5MOG35-46. Τα συντηθέμενα πεπτίδια καθαρίστηκαν με χρήση ημιπαρασκευαστικού RP-HPLC και ταυτοποιήθηκαν μέσω φασματομετρίας ESI-MS, συζεύχθηκαν με την οξειδωμένη μαννάνη και μελετήθηκαν μέσω της μεθοδολογίας ELISA