The role of heavy and light chain V regions in antigen binding by Fv domains of antibodies to Z-DNA

Abstract

Antibodies to Z-DNA can be induced by immunization and are also found in autoimmune individuals. Thus, anti-Z-DNA antibodies represent an autoimmune specificity that can be reproduced experimentally. The variable fragment (Fv) of anti-Z-DNA antibody Z22 was expressed by E. coli as a single-chain Fv (ScFv). When the light chain variable region (VL) of Z22 was replaced with a library of diverse VL cDNAs, only one VL out of several hundred, which differed at only five residues from that of Z22, supported Z-DNA binding. This VL yielded a scFv (LZ1-2) with specific Z-DNA binding, but its affinity was 100 to 200-fold lower than that of Z22. Replacement of the VH10-encoded Z22 VH chain with eleven other VH10-encoded VHs decreased Z-DNA binding activity, but increased binding to B-DNA and denatured DNA. These VHs had diverse complementarity determining region 3 (CDR3). A scFv (Z3-3) that did not bind Z-DNA differed from Z22 at only ten VH positions, four of which were in CDR3. Gene segment swapping and site-directed mutagenesis indicated that the major contribution of the Z22 VH is its CDR3. A scFv with the CDR3-framework region 4 (CDR3-FR4) of Z22 and the VH segment of Z3-3 had the same selective high affinity Z-DNA binding as Z22. Site-directed mutagenesis indicated that N99 and S98 in the Z22 VH, and F96 in VL, were important for antigen-binding. Certain substitutions in the VH CDR3 converted the selective Z22 scFv into a polyreactive scFv with autoantibody-like binding to B-DNA and denatured DNA. The separately expressed Z22 V domains associated stoichiometrically to reconstitute the antigen-bindin site. A VL F96W mutation, which in the LZ1-2 scFv reduced antigen binding affinity by two orders of magnitude, did not reduce the affinity of the VH-VL interaction, measured by surface plasmon resonance. The isolated Z22 VL domain did not interact with nucleic acids, but the VH domain alone bound Z-DNA specifically with an affinity similar to that of the Fab or Fvs of Z22 (KD=1.68x10^-8 M). Z22 VH binding to antigen was inhibited by association with the LZ1-2 VL, (with the F96W replacement). These in vitro results resemble the in vivo modulation of H chain autoreactivity that occurs with L chain substitution in receptor editing.

Τα αντισώματα στο Z-DNA μπορούν να προκληθούν με ανοσοποίηση και βρίσκονται επίσης σε αυτοάνοσα άτομα. Έτσι, τα αντισώματα αντι-Ζ-DNA αντιπροσωπεύουν μια αυτοάνοση ειδικότητα που μπορεί να αναπαραχθεί πειραματικά. Το μεταβλητό θραύσμα (Fv) του αντισώματος αντι-Ζ-DNA Ζ22 εκφράστηκε από Ε. coli ως Fv μονής αλυσίδας (ScFv). Όταν η μεταβλητή περιοχή ελαφριάς αλυσίδας (VL) του Z22 αντικαταστάθηκε με μια βιβλιοθήκη διαφορετικών VL cDNA, μόνο ένα VL από πολλές εκατοντάδες, το οποίο διέφερε μόνο σε πέντε υπολείμματα από αυτό του Z22, υποστήριξε τη δέσμευση Z-DNA. Αυτό το VL έδωσε ένα scFv (LZ1-2) με ειδική δέσμευση Z-DNA, αλλά η συγγένειά του ήταν 100 έως 200 φορές χαμηλότερη από εκείνη του Z22. Η αντικατάσταση της κωδικοποιούμενης από VH10 αλυσίδας Z22 VH με έντεκα άλλα VH που κωδικοποιούνται από VH10 μείωσε τη δραστηριότητα σύνδεσης του Z-DNA, αλλά αύξησε τη δέσμευση στο Β-DNA και το μετουσιωμένο DNA. Αυτά τα VH είχαν ποικίλη περιοχή προσδιορισμού της συμπληρωματικότητας 3 (CDR3). Ένα scFv (Z3-3) που δεν δέσμευε το Z-DNA διέφερε από το Z22 σε δέκα μόνο θέσεις VH, τέσσερις από τις οποίες ήταν σε CDR3. Η εναλλαγή τμημάτων γονιδίου και η τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση έδειξαν ότι η κύρια συνεισφορά του Z22 VH είναι το CDR3 του. Ένα scFv με την περιοχή πλαισίου CDR3 4 (CDR3-FR4) του Z22 και το τμήμα VH του Z3-3 είχε την ίδια επιλεκτική δέσμευση Z-DNA υψηλής συγγένειας με το Ζ22. Τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση έδειξε ότι τα N99 και S98 στο Z22 VH, και F96 στο VL, ήταν σημαντικά για τη δέσμευση αντιγόνου. Ορισμένες υποκαταστάσεις στο VH CDR3 μετέτρεψαν το εκλεκτικό Z22 scFv σε ένα πολυδραστικό scFv με δέσμευση παρόμοια με αυτοαντισώματα με Β-DNA και μετουσιωμένο DNA. Οι χωριστά εκφραζόμενες περιοχές Z22 V συσχετίζονται στοιχειομετρικά για την ανασύσταση της θέσης αντιγόνου-μπινδίνης. Μια μετάλλαξη VL F96W, η οποία στο LZ1-2 scFv μείωσε τη συγγένεια δέσμευσης αντιγόνου κατά δύο τάξεις μεγέθους, δεν μείωσε τη συγγένεια της αλληλεπίδρασης VH-VL, που μετρήθηκε με συντονισμό επιφανειακού πλασμονίου. Η απομονωμένη περιοχή Z22 VL δεν αλληλεπιδρά με νουκλεϊκά οξέα, αλλά η περιοχή VH μόνη της δέσμευε το Z-DNA ειδικά με μια συγγένεια παρόμοια με αυτή των Fab ή Fvs του Ζ22 (KD=1,68x10^-8 Μ). Η δέσμευση Z22 VH στο αντιγόνο αναστέλλεται μέσω συσχέτισης με το LZ1-2 VL, (με την αντικατάσταση F96W). Αυτά τα αποτελέσματα in vitro μοιάζουν με την in vivo ρύθμιση της αυτοαντιδραστικότητας της αλυσίδας Η που συμβαίνει με την υποκατάσταση της αλυσίδας L στην επεξεργασία υποδοχέα.