Συμβολή στη μελέτη της εφαρμογής βιοϋλικών στην αντιμετώπιση οστικών ελλειμμάτων στο πρόβατο

Abstract

Necessary elements for fracture healing include osteogenic cells, an osteoconductive matrix, an osteoinductive stimulus, mechanical stability and adequate vascular supply. Currently, autogenous bone graft is considered to be the gold standard. However, since complications of its use have been reported, bone substitutes have been proposed as potential alternatives. These materials are osteoconductive, supporting vascular and cellular ingrowth, but they are minimally osteoinductive. Recent research has focused on biomaterials, including combinations of mesenchymal stem cells (MSCs) with bone substitutes. MSCs can differentiate into osteoblasts and other cell types and secrete anti-inflammatory and angiogenic molecules. They are located in all tissues, with adipose tissue serving as the best option (Adipose-derived Stem Cells, ASCs), due to its abundance in body, easier and safer collection and minimal morbidity in the patient. According to the literature, considerably larger amounts of MSCs can be identified in the Stromal Vascular Fraction (SVF) of adipose tissue compared with bone marrow aspirate. SVF is a heterogeneous combination of ASCs, endothelial cells, pericytes, lymphocytes, mast cells and pre-adipocytes, thus possessing osteogenic, osteoinductive and immunomodulatory properties, anti-inflammatory and angiogenic capacity. Another advantage of SVF is the easy acquisition, without need for cell separation or culturing conditions, thus, it can be performed intraoperatively. Research on the use of fresh autologous SVF for bone healing has produced encouraging results in flat bones and defects created on femoral condyles proving even better osteoinductive ability and larger callus formation of SVF than in vitro cultured ASCs. In the international literature, no reports have been published regarding healing of long bone defects by using SVF on a Hydroxyapatite (HA) scaffold. The objective of this research was the evaluation of the feasibility of using SVF for the treatment or augmentation of the healing process of segmental bone defect in the metatarsus in an ovine model. Throughout the study period, the added value of ultrasonography (B-mode, Color and pulsed-wave Doppler) for early bone healing evaluation was assessed. Healthy, skeletally mature sheep were used in the research project. A unilateral, segmental mid-diaphyseal bone defect was created on the right metatarsus of the animals, under general and epidural anesthesia (Day 0, D0). Ostectomy was stabilized with a bone plate and appropriate screws. Each defect was managed by means of one of the following: i) use of HA bone paste to fill the defect (Group A, n = 6), ii) use of autogenous bone graft mixed with HA bone paste and placed in the defect (Group B, n = 6), iii) use of SVF mixed with HA bone paste injected into the defect (Group C, n = 6), iv) use of bone graft and SVF mixed with HA bone paste prior to apposition in the bone defect (Group D, n = 6). SVF had been previously isolated and properly prepared from adipose tissue of the lumbosacral region intraoperatively. Postoperatively each animal was evaluated by using clinical examination and imaging techniques (X-raying and ultrasonographic examination) of the defect on regular intervals for three months. Kaler scale (0-6 score) was employed to assess the severity of lameness in animals in the study. For the monthly quantitative assessment of the X-ray findings, Modified Lane and Sandhu radiological system (0-10 score) was used in two orthogonal views. Ultrasonographic assessment of longitudinal scans with a linear transducer along the length of the defect every ten days until D60, D75 and D90 included calculation of the length of the bone defect, as well as its vascularization (0-3 score). In addition, Doppler examination was used every ten days for a forty-day-period to investigate the changes in haemodynamic parameters of blood flow in the feeding artery of fractured metatarsus. After 90 days of ostectomy, the animals were euthanized and a segment of metatarsus (3 cm long) was excised and fixed in 10% neutral buffered formalin for histological analysis (0-15, Šantić scoring scale). Statistical analysis included comparisons among groups (Kruskal-Wallis or Pearson χ2 test) and correlations between assessment techniques (Spearman’s analysis of correlation). Statistical significance was set at p < 0.05. SVF was successfully isolated from the lumbosacral area of animals in Groups C and D and the mean yield was 1.77×106 mononuclear cells per milliliter. The comparison of clinical scores on each post-operative day indicated significant differences between the four groups on D1 to D30 (p < 0.01). On Day 60 and D90 postoperatively, animals in Group C were found with the best radiological score (p = 0.049 and p = 0.006 between groups, respectively). There was a correlation between the clinical and the X-ray findings (p < 0.0001 for all calculations throughout the study). Throughout the study period the bone defect was the shortest in animals of Group C. Ultrasonographic assessment on D75 and D90 confirmed that the length of the bone defect was the smallest in group C (p = 0.006 and p = 0.002 respectively, between groups). There was also a correlation between the length of the bone defect and the X-ray findings (p ≤ 0.037 for all calculations throughout the study). Ultrasonographic assessment of vascularization of the bone defect indicated that, neoangiogenesis reached a peak in all animals on Day 20, with animals of Groups C and D showing best results, followed Group B and finally Group A. After 20th postoperative day, blood flow started to decline. A significantly higher proportion of animals in groups B, C and D achieved score ‘0’ on D75 and D90 (in >83% of cases) than in group A (in 25% of cases) (p = 0.0003). The preoperative blood flow pattern of the cranial tibial artery was triphasic wave with high resistance and high systolic pattern examinations in all ewes. After ostectomy occurred RI and PI appeared a decrease and PSV and total volume increased for the first twenty days and after that point of time they returned towards normal values without statistical significant differences among Groups. On the last day of the study, histological analysis revealed the best healing score for sheep in Group C (p = 0.022 between groups). Concluding, this was the first study using fresh, autologous SVF to enhance bone healing of a segmental diaphyseal bone defect in a one-step surgical procedure in a large animal model. SVF isolation was found to be an easy, safe and effective technique. According to our results, SVF is osteogenic and osteoinductive and augments long bone healing. In the present study, SVF was found to enhance bone regeneration when combined with HA paste or cancellous bone. The animals in groups C and D, in which biomaterial inserted contained undifferentiated uncultured adipose-derived stem cells, were found to promote bone formation in terms of radiological, ultrasonographic and histological findings. In addition, it seems that the supplementation of autogenous cancellous bone graft with SVF enhances its bone regenerative properties. Finally, we support the use of ultrasonography for early bone healing evaluation.

Τα αναγκαία στοιχεία για την επιτυχή πώρωση ενός κατάγματος είναι τα οστεογενετικά κύτταρα, ένα οστεοκαθοδηγητικό μέσο, ένα οστεοεπαγωγικό ερέθισμα, η μηχανική σταθερότητα και η επαρκής αιματική ροή. Έως σήμερα, το αυτόλογο σπογγώδες οστεομόσχευμα θεωρείται ως το υλικό εκλογής. Ωστόσο, καθώς καταγράφονται κάποιες επιπλοκές από τη χρήση του, έχει προταθεί η εφαρμογή συνθετικών οστικών υποκατάστατων. Πρόκειται για υλικά με οστεοκαθοδηγητικές ιδιότητες, καθώς παρέχουν το κατάλληλο περιβάλλον για νεοαγγειογένεση και οστική αναγέννηση, ενώ είναι ελάχιστα ή καθόλου οστεοεπαγωγικά. Οι έρευνες των τελευταίων ετών κατευθύνονται προς εναλλακτικές θεραπείες με βιοϋλικά, όπως συνδυασμούς οστεοπρογονικών μεσεγχυματικών κυττάρων (Mesenchymal Stem Cells, MSCs) με οστεοκαθοδηγητικά ικριώματα. Τα MSCs έχουν την ικανότητα διαφοροποίησης σε οστεοβλάστες και άλλα είδη κυττάρων και τη δυνατότητα έκκρισης βιομορίων με ανοσορρυθμιστική και αγγειογενετική δράση. Εντοπίζονται σε όλους τους ιστούς αλλά η μεγαλύτερη αφθονία του λιπώδους ιστού, η ευκολότερη πρόσβαση και η ανώδυνη λήψη καθιστούν προτιμότερο το στρωματικό αγγειακό κλάσμα του λιπώδους ιστού (Stromal Vascular Fraction, SVF). Περαιτέρω πλεονεκτήματα αποτελούν η δυνατότητα για άμεση και διεγχειρητική προετοιμασία, καθώς και ο μεγάλος αριθμός MSCs. Πρόκειται για ένα υδάτινο ετερογενές μείγμα από MSCs λιπώδους ιστού (Adipose-derived Stem Cells, ASCs), ενδοθηλιακά κύτταρα, περικύτταρα, λεμφοκύτταρα, σιτευτικά κύτταρα και προ-λιποκύτταρα με οστεογενετική και οστεοεπαγωγική ικανότητα, ανοσορρυθμιστική και αγγειογενετική δράση. Η αποτελεσματικότητα του νωπού αυτόλογου SVF σε έρευνες που έχουν ήδη πραγματοποιηθεί είναι ενθαρρυντική για την πώρωση σε πλατέα οστά και ελλείμματα μηριαίων κονδύλων, καταδεικνύοντας μεγαλύτερη οστεοεπαγωγική δραστηριότητα και σχηματισμό ογκωδέστερου πώρου σε σύγκριση με τα καλλιεργημένα ASCs. Στην διεθνή βιβλιογραφία, δεν υπάρχουν γνωστές μελέτες οι οποίες διερευνούν την επίδραση του συνδυασμού SVF με ικρίωμα υδροξυαπατίτη (ΗΑ) στην πώρωση ελλειμμάτων μακρών οστών. Σκοπός του παρόντος ερευνητικού ήταν η διερεύνηση της σκοπιμότητας της χρήσης SVF για την ενίσχυση της πώρωσης τμηματικού οστικού ελλείμματος στη διάφυση του μεταταρσίου στο πρόβατο. Στη διάρκεια της μελέτης, διερευνήθηκε και η χρήση της υπερηχοτομογραφίας (B-mode, Color Doppler και παλμικού Doppler ροής) για την αξιολόγηση της πώρωσης κατά τα αρχικά στάδιά της. Χρησιμοποιήθηκαν υγιή, ενήλικα πρόβατα κατόπιν έγκρισης του πειραματικού πρωτοκόλλου. Υπό γενική και επισκληρίδια αναισθησία πραγματοποιήθηκε οστεκτομή στη διάφυση του δεξιού μεταταρσίου και τοποθετήθηκαν μεταλλική πλάκα και κοχλίες. Το οστικό έλλειμμα πληρώθηκε ως εξής: Πάστα Υδροξυαπατίτη (ΗΑ) (Ομάδα Α, 6 ζώα), συνδυασμός σπογγώδους οστεομοσχεύματος με ΗΑ (Ομάδα Β, 6 ζώα), συνδυασμός SVF με ΗΑ (Ομάδα Γ, 6 ζώα) και συνδυασμός όλων των βιοϋλικών (Ομάδα Δ, 6 ζώα). Το SVF συλλέχθηκε από το λιπώδη ιστό της οσφυοϊερής χώρας και προετοιμάστηκε διεγχειρητικά. Μετεγχειρητικά διενεργήθηκε κλινικός (αξιολόγηση της χωλότητας) και ακτινολογικός έλεγχος (μηνιαίως, δύο ακτινογραφήματα με διαφορά 90 μοιρών). Επιπλέον ανά δεκαήμερο έως την 60ή, κατόπιν την 75η και τέλος την 90ή ημέρα γινόταν υπερητομογραφική αξιολόγηση του μήκους του οστικού ελλείμματος και της αγγείωσής του (0-3). Επιπλέον, τις πρώτες 40 ημέρες του πειραματισμού ανά δεκαήμερο καταγράφονταν υπερηχοτομογραφικά οι αιμοδυναμικές παράμετροι της ροής του αίματος της πρόσθια κνημιαίας αρτηρίας των προβάτων. Κατά την τελευταία ημέρα του πειραματισμού (90ή), κατόπιν ευθανασίας, λαμβάνονταν οστεοτεμάχιο για ιστοπαθολογική εξέταση. Η στατιστική επεξεργασία περιελάμβανε συγκρίσεις μεταξύ των αποτελεσμάτων των διαφορετικών ομάδων (Kruskal-Wallis ή Pearson x2) και συσχετίσεις μεταξύ των διαγνωστικών δοκιμών (Spearman’s analysis of correlation). To επίπεδο σημαντικότητας είχε οριστεί στο p < 0,05. Η απομόνωση του SVF από την οσφυοϊερή περιοχή των ζώων των ομάδων Γ και Δ ήταν επιτυχής και απέδωσε κατά μέσο όρο 1,77×106 ζωντανά κύτταρα ανά ml. Από την 1η έως την 30ή ημέρα καταγράφονταν στατιστικώς σημαντική διαφορά στη χωλότητα μεταξύ των διαφορετικών ομάδων (p < 0,01). Την 60ή και την τελευταία ημέρα του πειραματισμού (ημέρα 90) διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά στην ακτινολογική εικόνα μεταξύ των ομάδων (p = 0,049 και p = 0,006, αντίστοιχα). Επιπλέον, διαπιστώθηκε ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της κλινικής και της ακτινολογικής εικόνας των ζώων (p < 0,0001 για όλη τη διάρκεια της μελέτης). Υπερηχοτομογραφικά, καθ’ όλη την πορεία της μελέτης η απόσταση των καταγματικών άκρων απεικονίζονταν πάντα μικρότερη στην ομάδα Γ. Την 75η και 90ή ημέρα του πειραματισμού διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων (p = 0,006 και p = 0,002, αντίστοιχα) με το μήκος του οστικού ελλείμματος στο μετατάρσιο των ζώων της ομάδας Γ να είναι το μικρότερο. Καταγράφηκε, επιπλέον, ισχυρή συσχέτιση με τιμές p ≤ 0,037 σε όλη τη διάρκεια της μελέτης μεταξύ των υπερηχοτομογραφικών μετρήσεων του μήκους και της ακτινολογικής εξέλιξης της πώρωσης. Σε όλα τα ζώα της μελέτης η νεοαγγείωση στο σημείο της οστεκτομής κορυφώθηκε την 20ή ημέρα του πειραματισμού. Μετά την 20ή ημέρα του πειραματισμού η αιμάτωση στην περιοχή άρχισε να μειώνεται. Σημαντικά μεγαλύτερο ποσοστό ζώων των ομάδων Β, Γ και Δ έλαβαν βαθμολόγηση 0 (ενδεικτικό απρόσκοπτης πορείας πώρωσης) την 75η και 90ή ημέρα πειραματισμού (83% των περιπτώσεων), έναντι του 25% της ομάδας Α (p = 0,0003). Η προεγχειρητική μέτρηση της ροής της πρόσθιας κνημιαίας αρτηρίας έδειξε ότι η ροή ήταν τριφασική με υψηλές αντιστάσεις. Μετεγχειρητικά οι δείκτες RI και PI μειώθηκαν, ενώ οι PSV και TBF αυξήθηκαν κατά το πρώτο εικοσαήμερο και ύστερα από αυτή τη χρονική στιγμή υποχώρησαν προς τις αρχικές τιμές, χωρίς ωστόσο, να τις προσεγγίσουν απόλυτα σε διάστημα 40 ημερών. Δεν κατεγράφησαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων πειραματισμού ως προς τις παραμέτρους ελέγχου της ροής του αίματος. Ιστολογικά, στο τέλος της μελέτης, καταγράφεται στατιστικώς σημαντική διαφορά στην πώρωση μεταξύ των ομάδων (p = 0,022 μεταξύ των ομάδων). Συμπερασματικά, η μελέτη μας ήταν η πρώτη που χρησιμοποίησε νωπό, αυτόλογο SVF που απομονώθηκε διεγχειρητικά για την ενίσχυση της πώρωσης οστικού ελλείμματος διάφυσης μακρού οστού σε μεγάλο ζωικό μοντέλο. Αποδείχθηκε ότι η διαδικασία απομόνωσης και η εφαρμογή SVF είναι μια εύκολη και αποτελεσματική τεχνική, ενώ στερείται ανεπιθύμητων παρενεργειών. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης, το SVF διαθέτει οστεογενετική και οστεοεπαγωγική ιδιότητα ενισχύοντας την πώρωση τμηματικού ελλείμματος μακρού οστού, όταν συνδυάζεται με πάστα ΗΑ ή σπογγώδες οστεομόσχευμα. Στα ζώα των ομάδων Γ και Δ, όπου τοποθετήθηκαν αδιαφοροποίητα μη καλλιεργημένα βλαστοκύτταρα του λιπώδους ιστού και στην ομάδα Β, που τοποθετήθηκε αυτόλογο σπογγώδες οστεομόσχευμα, τα ακτινολογικά, υπερηχοτομογραφικά και ιστολογικά ευρήματα ήταν συμβατά με βελτιωμένο σχηματισμό νέου οστού. Φαίνεται ότι η προσθήκη SVF σε αυτόλογο σπογγώδες οστεομόσχευμα ενισχύει τις οστεογενετικές και οστεοεπαγωγικές ιδιότητές του. Τέλος, υποστηρίζεται η χρήση της υπερηχοτομογραφίας, και η καταγραφή των αιμοδυναμικών παραμέτρων της ροής του αίματος του τροφοδοτούντος αγγείου, για την εκτίμηση της εξέλιξης της πώρωσης καταγμάτων στα αρχικά στάδια της.