Μελέτη του ρόλου στοιχείων του μικροπεριβάλλοντος στη ρύθμιση των νευροβλαστικών κυττάρων του εγκεφάλου σε νευροεκφυλιστικά φαινόμενα, καθώς και ως νευροπροστατευτικών παραγόντων

Abstract

In the postnatal mammalian brain, neural stem cells (NSCs) are located in specialized microenvironments, called stem cells niches, one of which is the Subependymal Zone (SEZ) of the lateral walls of the lateral ventricles. The neurogenetic niche of the Subependymal Zone constitutes a specialized microenvironment as it presents a special three dimensional cytoarchitecture with increased interactions between progenitors and other cell types of the niche, as well as a specialized system of extracellular matrix composition and blood vessels. Among them, laminin constitutes a major extracellular matrix molecule in the Subependymal Zone of the adult brain, while platelets have recently been recognized as an important cell population of the neurovascular unit, especially in neurodegenerative diseases. Cell-to-cell interactions and signals within the niche play an important role in the balance between NSC quiescence and activation, which is disrupted in cases of injury. The results of the present thesis reveal that neuronal and oligodendroglial lineage-restricted progenitor cells present divergent properties and a differential response to microenvironmental factors in polymorphic NSCs cultures assays, reflecting their differential adaptation within the brain. Specifically, neurogenesis is significantly affected by the cytoarchitecture, exhibiting significant spatial restrictions, and it shows a dependence on laminin, while oligodendrogenesis exhibits none of these constraints. Furthermore, the inhibition of integrin β1 enhanced the divergence between neurogenic and oligodendrogenic properties of NSCs in vitro. These observations are important for basic research and offer a tool to further investigate the mechanisms that regulate the divergence of stem/progenitor cells. Besides their main function, hemostasis, platelets also exhibit multiple other properties, which are mediated through released factors after platelet activation. We have previously shown that platelet factors favor the survival of NSCs in vitro, while a focal lysolecithin-induced demyelination in the adjacent corpus callosum provokes specific aggregation of platelets within the vasculature of the niche. Under brain injury or neurodegeneration platelets participate in inflammatory and immune responses, but their role on neural stem/progenitor cells is still not clear. Based on the above and aiming to investigate microenvironmental factors with a possible neuroprotective and regulatory effect on neural stem cells, we studied the possible regulatory role of platelets on NSC behavior and on their neurogenic and oligodendrogenic properties. Our data highlighted a protective role of platelets in vitro, as their addition (isolated from young mice ) to NSC cultures enhanced both the undifferentiated/progenitor state of NSCs, an effect found to be dependent on cell-to-cell interactions, as well as the presence of neuroblasts in the proximity of areas with higher cell densities (3D structures), but without affecting levels of neurogenesis and oligodendrogenesis. On the other hand, in vivo transient chemical platelet depletion combined with demyelination within the corpus callosum increased the presence of oligodendrocyte lineage cells within the SEZ, as well as in the corpus callosum. The absence of a consistent in vitro effect of platelets on oligodendrogenesis can be explained by considering that co-cultures constitute a special and simplifying system in comparison with cell-to-cell interactions which are observed within the brain. Furthermore, it indicates that oligodendrocyte regulation does not require direct platelet/progenitor cell contact, but it is mediated by other cell populations, such as the endothelium. Finally, we investigated the possible role of platelets in another neurodegenerative disease. Therefore, transient thrombocytopenia was also performed in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease (APP PS1 mice). Together, these findings suggest the important role of different microenvironmental factors on NSC behavior and cell fate commitment in vitro, revealing a higher dependence of neurogenesis and a significant resistance of oligodendrogenesis, in terms of cytoarchitecture and extracellular matrix composition. Furthermore, our data highlight the multidimensional regulatory role of platelets, which present a favorable effect, enhancing the progenitor state of NSCs in vitro and an inhibitory role on oligodendrocyte lineage cells after demyelination in the corpus callosum. An important role in these differential effects (direct or indirect and positive or negative) it is possible to have platelet numbers, which interact with stem/ progenitor cells, as well as the stimuli that platelets receive. Transplantations of isolated platelets into the mouse corpus callosum and investigation of neural stem/progenitor cell behavior, may contribute to a greater understanding of platelet response between homeostasis and neuropathology, thus providing new potential targets for the development of effective therapeutic approaches in degenerative diseases of the brain.

Στον ενήλικο εγκέφαλο των θηλαστικών, τα νευρικά βλαστικά κύτταρα (Neural Stem Cells, NSCs) εντοπίζονται σε εξειδικευμένες περιοχές, που ονομάζονται βλαστικές φωλεές, μια εκ των οποίων είναι η Υποεπενδυματική Ζώνη (Subependymal Zone, SEZ) των πλάγιων τοιχωμάτων των πλάγιων κοιλιών. Η νευρογενετική φωλεά της Υποεπενδυματικής Ζώνης αποτελεί ένα εξειδικευμένο μικροπεριβάλλον, καθώς παρουσιάζει μια ειδική τρισδιάστατη κυτταρική αρχιτεκτονική με αυξημένες αλληλοεπιδράσεις μεταξύ των προγονικών και άλλων κυττάρων, καθώς και ένα εξειδικευμένο σύστημα μορίων εξωκυττάριας ουσίας και αγγείων. Μεταξύ αυτών, η λαμινίνη αποτελεί ένα κύριο μόριο εξωκυττάριας ουσίας στην Υποεπενδυματική ζώνη του ενήλικου εγκεφάλου, ενώ τα αιμοπετάλια πρόσφατα έχουν αναγνωριστεί ως ένας σημαντικός πληθυσμός της νευροαγγειακής μονάδας, ιδιαίτερα σε νευροπαθολογικές καταστάσεις του εγκεφάλου. Οι κυτταρικές αλληλεπιδράσεις και τα σήματα που δέχονται τα νευρικά βλαστικά κύτταρα εντός της φωλεάς διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στην ισορροπία μεταξύ αδράνειας και ενεργοποίησής τους, η οποία διαταράσσεται σε περιπτώσεις τραυματισμού. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής αποκαλύπτουν ότι προγονικά κύτταρα νευρικής και ολιγοδενδρογλοιακής μοίρας παρουσιάζουν αποκλίνουσες ιδιότητες και διαφορετική απόκριση στους παράγοντες του μικροπεριβάλλοντος σε πολυμορφικές καλλιέργειες NSCs in vitro, αντανακλώντας τη διαφορετική προσαρμογή τους εντός του εγκεφάλου. Πιο συγκεκριμένα, προτείνεται ότι η νευρογένεση επηρεάζεται σημαντικά από την κυτταρική αρχιτεκτονική, εμφανίζοντας μεγαλύτερους χωρικούς περιορισμούς, ενώ παρουσιάζει και μια μεγαλύτερη εξάρτηση από τη λαμινίνη, σε σχέση με την ολιγοδενδρογένεση. Επιπρόσθετα, η αναστολή της β1 υπομονάδας των κύριων υποδοχέων εξωκυττάριας ουσίας, των ιντεγκρινών, ενίσχυσε σημαντικά την απόκλιση μεταξύ των νευρογενετικών και ολιγοδενδρογενετικών ιδιοτήτων των NSCs in vitro. Αυτές οι παρατηρήσεις είναι σημαντικές σε επίπεδο βασικής έρευνας και προσφέρουν εργαλεία για την περαιτέρω διερεύνηση των μηχανισμών που ρυθμίζουν τις συγκεκριμένες αποκλίσεις. Είναι γνωστό ότι τα αιμοπετάλια εκτός από την κύρια λειτουργία τους, την αιμόσταση, διαθέτουν επίσης πολλαπλές άλλες ιδιότητες, που διαμεσολαβούνται μέσω των παραγόντων που απελευθερώνουν έπειτα από ενεργοποίησή τους. Πρόσφατη ερευνητική δουλειά της ομάδας αποκάλυψε πως αιμοπεταλιακοί παράγοντες ευνοούν την επιβίωση των NSCs in vitro, ενώ η απομυελίνωση στο μεσολόβιο μυών επιφέρει συσσώρευση αιμοπεταλίων στα αιμοφόρα αγγεία της Υποεπενδυματικής ζώνης. Σε περιπτώσεις τραυματισμού ή εκφύλισης του εγκεφάλου τα αιμοπετάλια συμμετέχουν σε ανοσολογικές και φλεγμονώδεις αποκρίσεις, χωρίς ωστόσο να είναι ξεκάθαρος ο ρόλος τους ως προς τα νευρικά βλαστικά/προγονικά κύτταρα. Με βάση τα παραπάνω και στοχεύοντας στη διερεύνηση παραγόντων του μικροπεριβάλλοντος με πιθανή προστατευτική και ρυθμιστική δράση ως προς τα νευρικά βλαστικά κύτταρα, σε δεύτερο επίπεδο, η παρούσα διατριβή εστίασε στη διερεύνηση του ρόλου των αιμοπεταλίων στη συμπεριφορά των NSCs, ενώ στηριζόμενοι στις παραπάνω in vitro παρατηρήσεις, δόθηκε έμφαση στις νευρογενετικές και ολιγοδενδρογενετικές ιδιότητες, με στόχο την προσέγγιση προστατευτικών στρατηγικών σε εκφυλιστικές καταστάσεις. Τα αποτελέσματά μας ανέδειξαν έναν προστατευτικό ρόλο των αιμοπεταλίων in vitro, καθώς η προσθήκη τους (απομονωμένων από νεαρά πειραματόζωα) στις καλλιέργειες, ενίσχυσε τόσο την αδιαφοροποίητη/προγονική κατάσταση των NSCs, επίδραση που διαπιστώθηκε να εξαρτάται από τις διακυτταρικές αλληλεπιδράσεις (cell-to-cell interaction) μεταξύ των δυο πληθυσμών, αλλά και την παρουσία των νευροβλαστών σε περιοχές με υψηλές κυτταρικές πυκνότητες (3D δομές), χωρίς όμως να επηρεάζει τα επίπεδα νευρογένεσης και ολιγοδενδρογένεσης. Από την άλλη πλευρά, η in vivo διερεύνηση σε ένα μοντέλο παροδικής χημικής απαλοιφής των αιμοπεταλίων της περιφέρειας, σε συνδυασμό με απομυελινωτική βλάβη στο μεσολόβιο, οδήγησε σε αυξημένη παρουσία ολιγοδενδρογλοιακών κυττάρων εντός της SEZ, καθώς και στο μεσολόβιο. Η απουσία συμβατής in vitro επίδρασης των αιμοπεταλίων ως προς την ολιγοδενδρογένεση, μπορεί να εξηγηθεί λαμβάνοντας υπόψιν ότι οι συγκαλλιέργειες αποτελούν ένα ιδιαίτερο και απλουστευτικό σύστημα σε σχέση με τις αλληλεπιδράσεις των κυτταρικών τύπων που εμφανίζονται εντός του εγκεφάλου. Επιπρόσθετα, είναι μια ένδειξη ότι η ρύθμιση του ολιγοδενδρογλοιακού χαρακτήρα δεν απαιτεί την άμεση επαφή αιμοπεταλίων/προγονικών κυττάρων, αλλά επιτυγχάνεται έμμεσα με τη διαμεσολάβηση άλλων κυτταρικών πληθυσμών, όπως για παράδειγμα του ενδοθηλίου. Τέλος, εξετάστηκε ο πιθανός ρόλος των αιμοπεταλίων σε μια άλλη κατάσταση νευροεκφύλισης και για το σκοπό αυτό εφαρμόστηκε βαρχυπρόθεσμη θρομβοκυτταροπενία σε ένα διαγονιδιακό μοντέλο της νόσου Alzheimer (APP-PS1 μύες). Συνοψίζοντας, τα ευρήματα της παρούσας διατριβής αναδεικνύουν τον κρίσιμο ρόλο των παραγόντων του μικροπεριβάλλοντος στον καθορισμό των NSCs in vitro, αποκαλύπτοντας μια μεγαλύτερη εξάρτηση της νευρογένεσης και μια σημαντική ανθεκτικότητα της ολιγοδενδρογένεσης, ως προς την κυτταρική αρχιτεκτονική και κομβικούς παράγοντες εξωκυττάριας ουσίας. Επιπρόσθετα, υπογραμμίζουν την πολυδιάστατη ρυθμιστική δράση των αιμοπεταλίων, καθώς εμφανίζουν έναν ευνοϊκό ρόλο, ενισχύοντας την προγονική κατάσταση των NSCs in vitro, ενώ αντίθετα μια ανασταλτική δράση ως προς τα κύτταρα ολιγοδενδρογλοιακής μοίρας σε καταστάσεις απομυελίνωσης in vivo. Σημαντικό ρόλο σε αυτές τις διαδικασίες και διαφορικές επιδράσεις (άμεσες ή έμμεσες και θετικές ή αρνητικές) φαίνεται να διαδραματίζει ο αριθμός και η ποσότητα των αιμοπεταλίων που αλληλοεπιδρούν με τα βλαστικά και προγονικά κύτταρα, καθώς και τα εκάστοτε ερεθίσματα που λαμβάνουν τα αιμοπετάλια. Οι μεταμοσχεύσεις αυτών στο μεσολόβιο μυών υπό φυσιολογικές καταστάσεις ομοιόστασης και η διερεύνηση της συμπεριφοράς των νευρικών βλαστικών/προγονικών κυττάρων, θα συμβάλλει στη μεγαλύτερη κατανόηση της λειτουργικότητας και απόκρισης των αιμοπεταλίων, μεταξύ καταστάσεων ομοιόστασης και παθογένειας, παρέχοντας νέους πιθανούς στόχους για την ανάπτυξη μελλοντικών θεραπευτικών προσεγγίσεων σε εκφυλιστικές καταστάσεις του εγκεφάλου.