Μελέτη των cis και trans παραγόντων που συμμετέχουν στην κοινή μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων κυτταροκινών και του ιού HIV-1

Abstract

HIV infection is characterized by chronic activation of the immune system, uncontrolled viral replication, and a gradual decline in CD4+ T helper cells (Th cells). Studies show that the virus is not completely eliminated in the plasma of patients. This inability to eliminate the virus is attributed to cells that serve as a viral reservoir and are responsible for the latency of infection. The viral reservoir consists of cells that harbor transcriptionally integrated silent proviruses that are capable of producing infectious virions after treatment interruption. Once HIV is integrated into the host genome, its transcription is regulated by a complex of cis and trans factors. Many studies suggest that repressive chromatin states, DNA methylation, and post-transcriptional changes in histones and non-histone proteins, as well as host transcription factors and the HIV-1 Tat protein, determine the transition to stable latency. The presence of this latent reservoir is associated with chronic immune activation and persistent inflammation. One of the most important effects of chronic HIV-1 infection is the dysregulation of the expression of a number of cytokines such as IL-2. The expression of IL-2 plays a critical role in infection as it is the first cytokine secreted by naive Th cells after their activation by antigens, and it has been found to be downregulated in HIV-1 patients. This was confirmed by in vitro studies using Jurkat T cells, which can express the stably integrated HIV-1 Tat or the entire stably integrated virus in their genome. IL-2 production is a measure of immunological activation of T cells via the downstream T cell receptor (TCR) pathway. Therefore, impaired IL-2 expression is associated with deficient development and proliferation of lymphocytes, monocytes, and macrophages, as well as inefficient viral replication and spread. For this reason, IL-2 is also important for latency.The aim of our study was to investigate whether chromosomal interactions between the IL-2 promoter and the HIV-1 LTR could be responsible for a stochastic choice of transcriptional expression between IL-2 and HIV-1 in Th cells and whether Ets-2 is involved in these interactions. To this end, Jurkat T cell lines carrying a noninfectious copy of HIV-1 (Jurkat-Lat) or an HIV-1-LTR region (Jurkat-LTRG) or none (Jurkat) were cultured for 6 hours ± mitogens (P/I). The mRNA of IL-2, Ets-2, HIV1 Tat, and LTR-GFP reporter genes was determined by qPCR. In P/I-stimulated cells, IL-2 mRNA levels were increased in all cell lines, whereas HIV-1 LTR mRNA levels were increased in Jurkat-Lat and Jurkat-LTRG cells; Ets-2 mRNA levels were decreased in Jurkat and Jurkat-Lat cells, and IL-2 expression was lower in J-Lat cells after induction compared with Jurkat and J-LTRG cells. CoIP assays showed a strong protein-protein interaction between Ets-2 and Tat mainly in non stimulated cells. ChIP assays confirmed the involvement of Ets-2 and Tat in IL-2 and HIV-1 transcriptional regulation by their simultaneous presence on the ARRE-1/TATA and ARRE-2 sequences of the IL-2 promoter and the RATS element of the HIV-1 LTR. The presence of Tat on these elements was more pronounced in stimulated cells. Finally, 3C experiments showed that the IL-2 promoter and HIV-1 LTR were localized in close proximity in the nucleus of unstimulated cells. Our results suggest that the presence of HIV-1 Tat on the regulatory elements of IL-2 inhibits gene expression by preventing the binding of RNA Poll II to the IL-2 promoter. In unstimulated cells, IL-2 and HIV-1 are co-regulated by 3D interactions between the IL-2 promoter and the HIV-1 LTR. This chromosomal interaction no longer exists after induction. The 3D structure between IL-2 and HIV-1 LTR and a physical protein-protein interaction between Ets-2 and Tat may explain the common regulation of IL-2 and HIV-1.

Η λοίμωξη από τον ίο HIV-1 χαρακτηρίζεται από χρόνια ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος και ανεξέλεγκτο ιϊκό πολλαπλασιασμό που οδηγεί σταδιακά σε μείωση των CD4+ T helper (Th) βοηθητικών κυττάρων. Παρά την αντιρετροϊκή θεραπεία που λαμβάνουν οι ασθενείς, μελέτες δείχνουν πως δεν υπάρχει πλήρης εξάλειψη του ιού, δημιουργώντας έτσι ένα «ιϊκό απόθεμα», εκεί όπου ο ιός παραμένει σε καταστολή ώσπου να δοθεί το κατάλληλο σήμα για την μεταγραφική ενεργοποίησή του. Αμέσως μετά την ένθεση του ιού στο γονιδίωμα μια σειρά cis στοιχείων και trans παραγόντων ρυθμίζουν την μεταγραφή του. Μελέτες δείχνουν πως τόσο κυτταρικοί όσο και ιϊκοί μεταγραφικοί παράγοντες, DNA μεθυλιώσεις, η κατάσταση στην οποία βρίσκεται η χρωματίνη αλλά και μετά -μεταφραστικές τροποποιήσεις διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην παραμονή του ιού σε μεταγραφική καταστολή η οποία σχετίζεται με χρόνια ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος και τη φλεγμονή. Μια από τις σημαντικότερες επιδράσεις της χρόνιας λοίμωξης από τον ιό είναι η διαταραχή στην έκφραση πολλών κυτταροκινών όπως είναι η IL-2, κυτταροκίνη που εκφράζεται από τα παρθενικά Τ κύτταρα αμέσως μετά την έκθεση στον ιό. Η έκφραση της IL-2 έχει βρεθεί να μειώνεται σε ασθενείς που φέρουν τον ιό, ενώ έχει επιβεβαιωθεί και σε Τ λευχαιμικές κυτταρικές σειρές Jurkat που φέρουν ένα τμήμα ή ολόκληρο το γονιδίωμα του ιού. Η παραγωγή της IL-2 είναι ένας δείκτης ενεργοποίησης των Τ κυττάρων μέσω του TCR μονοπατιού και έτσι η διαφορική έκφραση της σχετίζεται μη επαρκή ανάπτυξη και διαφοροποίηση λεμφοκυττάρων, μονοκυττάρων και μακροφάγων, καθώς και ανεπαρκή ιϊκή αναπαραγωγή. Για τον λόγο αυτό η ρύθμιση της έκφρασης της IL-2 είναι απαραίτητη για την έκφραση του ιού όσο και για την εδραίωση της κατάστασης σίγασης του ιού.Σκοπός της παρούσας διατριβής αποτελεί η μελέτη της πιθανής αλληλεπίδρασης του υποκινητή της IL-2 και του HIV-1 LTR και κατά πόσο αυτή είναι υπεύθυνη για μια στοχαστική διαδικασία στην έκφραση του ιού και της IL-2, αλλά και κατά πόσο ο παράγοντας Ets-2 εμπλέκεται σε αυτό. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν Τ λευχαιμικές κυτταρικές σειρές που φέρουν είτε ένα αντίγραφο του ιικού γονιδιώματος (Jurkat-Lat), είτε το HIV-1 LTR (Jurkat-LTRG), είτε τίποτα από τα παραπάνω (Jurkat). Η καλλιέργεια των κυττάρων έγινε παρουσία ή απουσία μιτογόνων για 6h και ακολούθως καθορίστηκαν τα επίπεδα mRNA των IL-2, Ets-2, HIV1-Tat και LTR-GFP με qPCR. Επιβεβαιώσαμε την αυξημένη έκφραση της IL-2 σε κύτταρα παρουσία μιτογόνων αλλά και την μείωση στην έκφραση του παράγοντα Ets-2 κυτταρικές σειρές Jurkat and Jurkat-Lat. Στη συνέχεια ελέγχθηκε με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης η πρόσδεση άμεσα ή έμμεσα των παραγόντων αυτών στα ρυθμιστικά στοιχεία της IL-2 και του HIV-1. Παρατηρήσαμε πρόσδεση του Ets-2 στις αλληλουχίες ARRE-1/TATA, ARRE-2 και RATS σε όλες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν. Παράλληλα, παρατηρήθηκε διαφοροποίηση στην πρόσδεση της RNA Pol II στα ίδια ρυθμιστικά στοιχεία. Επιπλέον, η παρουσία του HIV-1 Tat στις ίδιες λειτουργικές περιοχές, μας οδήγησε στον έλεγχο για πιθανή αλληλεπίδραση των παραγόντων Ets-2 και HIV-1 Tat, καθώς ο HIV-1 Tat δεν έχει την ικανότητα πρόσδεσης σε περιοχές DNA. Η αλληλεπίδραση των δύο παραγόντων επιβεβαιώθηκε με πειράματα συγκατακρήμνισης πρωτεΐνης, ενώ αντίστοιχα ελέγχθηκε η αλληλεπίδραση του παράγοντα HIV-1 Tat με τον NFAT2, χωρίς ωστόσο να υπάρχει αλληλεπίδραση μεταξύ τους. Τέλος, επιβεβαιώθηκε η αρχική μας υπόθεση για γειτνίαση στον πυρήνα του κυττάρου του υποκινητή της IL-2 με το HIV-1 LTR στα J-Lat κύτταρα και σε συνθήκες ηρεμίας μόνο, πραγματοποιώντας πειράματα 3C (Chromosome conformation capture). Οι δύο ρυθμιστικές περιοχές βρίσκονται σε κοντινή απόσταση, όταν αυτά βρίσκονται σε ηρεμία αλλά όχι στα ενεργοποιημένα κύτταρα. Αντίστοιχη αλληλεπίδραση δεν φάνηκε να υπάρχει στα J-LTRG κύτταρα σε καμία συνθήκη, στα οποία δεν εκφράζεται ο παράγοντας HIV-1 Tat. Πιθανόν οι δύο περιοχές να βρίσκονται σε εγγύτητα λόγω της αλληλεπίδρασης των παραγόντων Ets-2 και HIV-1 Tat, όπως προκύπτει από τα πειράματα 3C σε κύτταρα J-LTRG που εκφράζουν παροδικά τον Tat. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας έδειξαν ότι ο Tat παρεμποδίζει την RNA Pol II να προσεγγίσει τον υποκινητή της IL-2 και να ξεκινήσει τη μεταγραφή του γονιδίου με αποτέλεσμα τη μειωμένη έκφραση της IL-2. Σε συνθήκες ηρεμίας των κυττάρων υπάρχει κοινή ρύθμιση της IL-2 και του HIV-1 μέσω 3D αλληλεπιδράσεων σε επίπεδο χρωματίνης ανάμεσα στον υποκινητή της IL-2 και το HIV-1-LTR, που διαταράσσεται μετά την επαγωγή των κυττάρων. Η χρωμοσωμική αυτή αλληλεπίδραση παύει να υφίσταται όταν μειώνεται η έκφραση του Ets-2, δηλαδή όταν τα κύτταρα ενεργοποιούνται. H τρισδιάστατη αυτή δομή μεταξύ του υποκινητή της IL-2 και του HIV-1-LTR με την συμμετοχή των Tat και Ets-2 μπορεί να εξηγήσει την συνρύθμιση των IL-2 και HIV-1.