Ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης και έλεγχος δράσης του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2 στην έκφραση κυτταροκινών σε παρθενικά και μνημονικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα

Abstract

The activation and differentiation of naive T helper (Th cells) is crucial for the maintenance of adequate defense and immune regulation. Activation of Th cells induces signaling pathways that lead to the activation of key lymphotropic factors such as NFAT, NF-κB and AP-1, which are involved in the activation of IL-2 transcription. IL-2 is the first cytokine produced when naive Th cells are activated and differentiate into proliferating pre-Th0 precursors. According to our previous work, the IL-2 gene is repressed in naive Th cells by the transcription factor Ets-2, which binds to the ARRE-2 element of the proximal IL-2 promoter. When naive Th cells are activated, Ets-2 shifts to the ARRE-1 region of the IL-2 promoter, loses its repressive effect and its expression level is reduced. When naive Th0 cells are activated, they differentiate into different subsets of Th cells depending on the type and concentration of antigen, the strength of TCR signaling, the cytokines present in the cell environment and the differential expression of certain transcription factors. The aim of this work was to investigate the regulation of Εts-2 expression and its role in the expression of transcription factors involved in the activation and differentiation of Th cells, as well as its possible involvement in the pathogenesis of autoimmune diseases due to a disturbance in the regulation of transcription factors involved in the differentiation of Th cells. First, we investigated the possible influence of Ets-2 on the expression of the lymphotropic factors NFAT2, NF-κΒ p65, c-Jun and c-Fos. Our results showed that overexpression of Ets-2 in the Jurkat T cell line resulted in upregulation of NFAT2 and c-Jun levels. Although Ets-2 led to an increase in NF-κΒ p65 protein levels, it had no effect on NF-κB p65 mRNA synthesis. Finally, overexpression of Ets-2 increased c-Fos mRNA in both stimulated and non-stimulated Jurkat cells, whereas it increased c-Fos protein levels only in stimulated cells. Τhus, Ets-2 induces the expression of important lymphotropic factors by either physically interacting with gene promoters or by participating in signaling pathways that directly affect their expression. We then examined the gene expression of Ets-2 as well as the gene expression of the transcription factors GATA-3, RORγt and Foxp3, which are involved in Th cell differentiation. We then examined the role of Ets-2 in regulating the expression of GATA-3, RORγt and Foxp3 and vice versa to investigate the role of Ets-2 in Th cell differentiation. The results of the experiments investigating the influence of Ets-2 on the expression of RORγt showed that Ets-2 downregulated RORγt levels only in non-stimulated Jurkat cells. The experiments investigating the influence of Ets-2 on Foxp3 expression and vice versa showed that overexpression of Ets-2 led to a significant decrease in Foxp3 expression, while overexpression of Foxp3 downregulated Ets-2 levels. To confirm the inverse relationship between Ets-2 and Foxp3 we performed Ets-2 knockdown experiments which resulted in an increase in Foxp3 expression, confirming the suppressive role of Ets-2 in Foxp3 expression. Since Ets-2 has binding sites on the Foxp3 promoter, we subsequently performed CHIP analysis, which confirmed the binding of Ets-2 to the Foxp3 promoter. Since perturbations in the regulation of transcription factors involved in Th cell differentiation can lead to the development of pathological Th cell clones and the subsequent occurrence of autoimmune diseases, we investigated the potential importance of Ets-2 in the pathogenesis of multiple sclerosis (MS). To this end, we examined the expression of Ets-2 and Foxp3 in regulatory Th cells (Tregs) derived from MS patients and healthy controls. We found that Foxp3 was significantly reduced in Tregs from MS patients, while Ets-2 was significantly increased compared to Tregs from healthy controls. These results, together with our previous work investigating the role of Ets-2 in Foxp3 expression, suggest that Ets-2, which is upregulated in Tregs of MS patients, may suppress Foxp3 expression. The decreased Foxp3 levels observed in MS patients may indicate a defect in the suppression mechanism of IL-2, leading to a subsequent increase in IL-2 expression. In conclusion, our results suggest a suppressive role of Ets-2 in the development and function of Tregs and its contribution to the pathophysiology of MS.

Η ενεργοποίηση και η διαφοροποίηση των Τ βοηθητικών (Th) κυττάρων είναι διαδικασίες καθοριστικής σημασίας για τη διατήρηση επαρκούς άμυνας και τη ρύθμιση της λειτουργίας του ανοσοποιητικού συστήματος. Η ενεργοποίηση των Τh κυττάρων επάγει σηματοδοτικά μονοπάτια τα οποία οδηγούν στην ενεργοποίηση σημαντικών λεμφοτροπικών παραγόντων όπως των NFAT, NF-κΒ και AP-1, οι οποίοι εμπλέκονται στην ενεργοποίηση της μεταγραφής της ΙL-2. Η IL-2 είναι η πρώτη κυτταροκίνη που παράγεται όταν τα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα ενεργοποιούνται και διαφοροποιούνται σε επαγώγιμα Th0 λεμφοκύτταρα. Σύμφωνα με μελέτη του εργαστηρίου μας, ο μεταγραφικός παράγοντας Εts-2 προσδένεται στην περιοχή ARRE-2 του υποκινητή της IL-2 σε παρθενικά Τh κύτταρα και καταστέλλει την έκφρασή της. Κατά την ενεργοποίηση των παρθενικών Τh κυττάρων, ο Εts-2 μετακινείται στην ARRE-1 περιοχή του υποκινητή της ΙL-2 και χάνει την κατασταλτική του δράση ενώ παράλληλα τα επίπεδα έκφρασής του μειώνονται. Μετά την ενεργοποίησή τους ως αποτέλεσμα της αντιγονοπαρουσίασης τα παρθενικά Τh κύτταρα ανάλογα με το είδος και τη συγκέντρωση του αντιγόνου, την ισχύ του σήματος TCR, το κυτταροκινικό περιβάλλον στο οποίο επιτελέστηκε η ενεργοποίηση και τη διαφορική έκφραση μεταγραφικών παραγόντων διαφοροποιούνται στους διαφορετικούς υποληθυσμούς Τh κυττάρων.Η παρούσα διατριβή στοχεύει στη διερεύνηση των μηχανισμών ρύθμισης της έκφρασης του Εts-2, καθώς και του ρόλου του στη ρύθμιση της έκφρασης μεταγραφικών παραγόντων οι οποίοι εμπλέκονται στις διαδικασίες της ενεργοποίησης και διαφοροποίησης των Τh κυττάρων. Η συγκεκριμένη μελέτη θα εξετάσει επίσης την πιθανή εμπλοκή του Εts-2 στην παθογένεια αυτοάνοσων νοσημάτων λόγω δυσλειτουργίας των μηχανισμών ρύθμισης των μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση των Τh κυττάρων. Αρχικά διερευνήσαμε το ρόλο του Εts-2 στη ρύθμιση της έκφρασης των λεμφοτροπικών παραγόντων NFAT2, NF-κΒ p65, c-Jun και c-Fos. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των πειραμάτων που διεξήχθησαν στην κυτταρική σειρά Jurkat, προκύπτει ότι ο Εts-2 είχε επαγωγικό ρόλο στην έκφραση του NFAT2 και του c-Jun. Θετική ρύθμιση ασκεί στην έκφραση της πρωτεΐνης του NF-κB p65, ωστόσο δεν επέφερε κάποια αλλαγή στα επίπεδα του NF-κΒ p65 mRNA. Εξετάζοντας τη δράση του Εts-2 στη ρύθμιση της έκφρασης του c-Fos παρατηρήσαμε ότι η υπερέκφραση του Εts-2 είχε ως αποτέλεσμα αύξηση των επιπέδων του c-Fos mRNA τόσο στα μη ενεργοποιημένα όσο και στα ενεργοποιημένα κύτταρα. Ωστόσο οδήγησε σε αύξηση των πρωτεϊνικών επιπέδων του c-Fos μόνα στα ενεργοποιημένα κύτταρα. Επομένως ο Εts-2 έχει επαγωγικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης λεμφοτροπικών παραγόντων οι οποίοι εμπλέκονται στην ενεργοποίηση των Τh λεμφοκυττάρων, είτε μέσω της άμεσης αλληλεπίδρασής του με τους εξεταζόμενους λεμφικούς παράγοντες, είτε μέσω της συμμετοχής του σε σηματοδοτικά μονοπάτια που επηρεάζουν άμεσα την έκφρασή τους. Στη συνέχεια προχωρήσαμε στη μελέτης της γονιδιακής έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Εts-2 καθώς και των μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση των Τh κυττάρων και συγκεκριμένα των: GATA-3, RORγt και Foxp3, σε παρθενικά και μνημονικά Τh λεμφοκύτταρα. Ακολούθως εξετάσαμε το ρόλο του Εts-2 στην έκφραση των GATA-3, RORγt και Foxp3 και το αντίστροφο με σκοπό να αποσαφηνισθεί η δράση του Εts-2 στη διαδικασία διαφοροποίησης των Τh κυττάρων. Ενδιαφέρον παρουσίασαν τα αποτελέσματα των πειραμάτων που εξέτασαν τη δράση του Εts-2 στην έκφραση του RORγt, καθώς η υπερέκφραση του Εts-2 επέφερε μείωση των επιπέδων του RORγt μόνο στα μη ενεργοποιημένα κύτταρα. Τα πειράματα διερεύνησης της δράσης του Εts-2 στην έκφραση του Foxp3 καθώς και τα πειράματα μελέτης του ρόλου του Foxp3 στην έκφραση του Εts-2 παρουσίασαν επίσης ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που προέκυψαν η υπερέκφραση του Εts-2 οδήγησε σε σημαντική μείωση της έκφρασης του Foxp3, αλλά και η υπερέκφραση του Foxp3 μείωσε τα επίπεδα του Εts-2. Για να επιβεβαιώσουμε την αντίστροφη σχέση μεταξύ της έκφρασης των ανωτέρω μεταγραφικών παραγόντων προχωρήσαμε σε πειράματα αποσιώπησης του Εts-2 τα οποία είχαν ως αποτέλεσμα αύξηση των επιπέδων έκφρασης του Foxp3, επιβεβαιώνοντας τον κατασταλτικό ρόλο του Εts-2 στην έκφραση του Foxp3. Στη συνέχεια, γνωρίζοντας την ύπαρξη θέσεων πρόσδεσης του Εts-2 στον υποκινητή του Foxp3, αποδείξαμε ότι ο Εts-2 προσδένεται στον υποκινητή του Foxp3.Καθώς η δυσλειτουργία των μηχανισμών ρύθμισης των μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση των Τh κυττάρων μπορεί να οδηγήσει στη δημιουργία παθολογικών Τh κλώνων και την επακόλουθη εμφάνιση αυτοάνοσων νοσημάτων, επόμενο βήμα ήταν να διερευνήσουμε την πιθανή εμπλοκή του Εts-2 στο αυτοάνοσο νόσημα της σκλήρυνσης κατά πλάκας (ΣΚΠ). Για αυτό το λόγο εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασής του Εts-2 και του Foxp3 σε ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Tregs) ασθενών με ΣΚΠ και προχωρήσαμε στη σύγκρισή τους με τα αντίστοιχα των υγιών δοτών. Οι ασθενείς με ΣΚΠ παρουσίασαν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του Εts-2 συγκριτικά με τους υγιείς δότες, ενώ παρουσίασαν χαμηλότερα επίπεδα Foxp3 συγκριτικά με τα υψηλότερα επίπεδα των υγιών δοτών. Τα αποτελέσματα αυτά σε συνδυασμό με αυτά των προηγούμενων πειραμάτων διερεύνησης του ρόλου του Εts-2 στην έκφραση του Foxp3, μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Εts-2, ο οποίος υπερεκφράζεται στα Τ ρυθμιστικά κύτταρα των ασθενών με ΣΚΠ, μπορεί να ασκεί αρνητική ρύθμιση στην έκφραση του Foxp3. Τα χαμηλά επίπεδα του Foxp3 που παρατηρήθηκαν στους ασθενείς μπορεί να υποδηλώνουν δυσλειτουργία στο μηχανισμό καταστολής της έκφρασης της ΙL-2 με αποτέλεσμα την επακόλουθη αύξηση των επιπέδων της. Επομένως, τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ένα κατασταλτικό ρόλο του Εts-2 στην ανάπτυξη και τη λειτουργία των Tregs και την επακόλουθη εμπλοκή του στην παθογένεια της ΣΚΠ.