Valorisation of lignocellulosic biomass for the production of fructose and furan monomer derivatives

Abstract

Over the past few years, the interest in lignocellulose biomass biorefineries has shifted from the production of biofuels to the development of processes for high-added value chemical synthesis. The present work attempts to develop processes for the valorization of lignocellulosic substrates, namely beechwood, pine and corn stover, with the aim to produce fructose and 5-hydroxymethylyfurfural (HMF). Additionally, this thesis examines the discovery and production of a galactose oxidase from the filamentous fungus Fusarium oxysporum as well as its ability to catalyze oxidation reactions on HMF for the production of furan monomers. In the first stage of the thesis, beechwood biomass was studied as the main feedstock for the production of HMF. Initially, these samples were subjected to an oxidative pretreatment (OxiOrganosolv) with the use of aqueous solutions of ethanol (EtOH), acetone (ACO) and tetrahydrofuran (THF) as the solvent. Subsequently, enzymatic saccharification and fermentation experiments were carried out on the cellulose-rich pulps that derived from the pretreatment with the aim of evaluating them as the raw material for fructose production. The best results were observed for the sample pretreated at 175 oC for 120 min, leading to the production of 55.2 g fructose/ 100 g pretreated biomass. As a result, this sample was used for a scale-up saccharification and isomerization experiment that led to the production of a hydrolysate with a concentration of 104.5 g/L fructose and 25.0 g/L glucose. This hydrolysate was then used to study the chemical dehydration of sugars to HMF using acid solvents. Out of the all the solvents studied, formic acid (3.5% w/w) proved to be the best performing one leading to the production of HMF with a 55.8% selectivity. In the next stage of the thesis, beechwood and pine biomass were subjected to OxiOrganosolv pretreatment with the addition of polyoxometalate catalysts in the solvent, with the aim to examine both the effect of the nature of the biomass used as a feedstock, and the addition of the catalysts in a variety of organic solvents. In specific, the organic solvents in these experiments were EtOH, ACO, THF, as well as isobutanol (iBuOH), while the polyoxometalate catalysts were the commercially available phosphomolybdic acid H3PMo12O40 x H2O (HPMo), as well as the custom- made metal substituted catalysts FePMo and CuPMo. The best performing beechwood sample led to the production of 54.9 g fructose/ 100 g pretreated biomass, while the best performing pine sample 53.4 g fructose/ 100 g pretreated biomass, respectively, both for pretreatment with iBuOH at 175 oC for 120 min in the absence of catalyst. Subsequently, the best performing samples were subjected to chemical dehydration experiments with formic acid (3.5% v/v) leading to the production of HMF with 49.9% selectivity. The third stage of the thesis included the pretreatment of corn stover biomass using microwave heating in order to compare this heating mechanism with the resistance mediated heating of the traditional autoclave pretreatment. These experiments took place at 150 oC with a mixture of water: ACO as the solvent with the addition of acetic acid as the catalyst. Ten different runs were carried out in order to discover the effect of acetic acid concentration and pretreatment duration on the biomass, while the evaluation of the samples was performed by the results of enzymatic saccharification experiments. The results showed that the best performing material was the one pretreated with an acetic acid concentration of 0.5% v/v for 120 min. For the sake of comparison, the same material was subjected to autoclave pretreatment under the same conditions. The samples of the microwave and autoclave pretreatment were also subjected to saccharification and isomerization experiments yielding 28.4 and 28.7 g fructose/ 100 g pretreated biomass, respectively. However, the total pretreatment times of the two processes exhibited a discrepancy of 1 h highlighting the potential of microwaves in achieving the same results in shorter amounts of time. Finally, with the aim of discovering novel biocatalysts for the bioconversion of furans into high added value monomers, the last stage of the thesis included the examination of a protein with galactose oxidase activity from F. oxysporum. This enzyme was selected after searching for oxidative enzymes with activity on furans that belong to the AA5_2 family of the CAZy database. The enzyme encoding gene was isolated from the DNA of the microorganism using molecular techniques and produced by means of heterologous expression in Pichia pastoris X33 cells. After the determination of its optimal conditions, the enzyme was able to efficiently oxidize HMF as well as its oxidative derivatives, proving that an integrated chemoenzymatic process for the production of oxidative furan monomers from lignocellulose is possible.

Τα τελευταία χρόνια, το ενδιαφέρον για βιοδιϋλιστήρια λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας έχει μεταφερθεί από την παραγωγή βιοκαυσίμων στην ανάπτυξη διεργασιών για τη σύνθεση χημικών υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η παρούσα διατριβή αποσκοπεί στην ανάπτυξη διεργασιών για την αξιοποίηση υποστρωμάτων λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας, όπως οξιάς, πεύκου και στελεχών αραβοσίτου, με σκοπό την παραγωγή φρουκτόζης και 5-υδροξυμέθυλφουρφουράλης (HMF). Επιπλέον, εξετάζει την ανακάλυψη και παραγωγή μιας οξειδάσης της γαλακτόζης από το νηματοειδή μύκητα Fusarium oxysporum καθώς και την ικανότητά του να καταλύει αντιδράσεις οξείδωσης του HMF για την παραγωγή μονομερών του φουρανίου. Στο πρώτο στάδιο της διατριβής μελετήθηκε ως κύρια πηγή λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας το ξύλο οξιάς για την παραγωγή HMF. Αρχικά, τα δείγματα αυτά υπέστησαν μια ήπια προκατεργασία οξείδωσης (OxiOrganosolv) με χρήση υδατικών διαλυμάτων αιθανόλης (EtOH), ακετόνης (ACO), και τετραϋδροφουρανίου (THF) ως διαλύτη. Ακολούθησαν πειράματα ενζυμικής υδρόλυσης και ισομερείωσης στις πλούσιες σε κυτταρίνη πούλπες που προέκυψαν από την προκατεργασία με στόχο την αξιολόγηση αυτών ως πρώτη ύλη για την παραγωγή φρουκτόζης. Τα βέλτιστα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν για το δείγμα που προκατεργάστηκε στους 175 οC για 120 min, οδηγώντας στην παραγωγή 55.2 g φρουκτόζης/ 100 g προκατεργασμένης βιομάζας. Έτσι, το δείγμα αυτό χρησιμοποιήθηκε για ένα νέο πείραμα υδρόλυσης και ισομερείωσης μεγαλύτερης κλίμακας, το αποτέλεσμα του οποίου ήταν η παραλαβή ενός υδρολύματος με συγκέντρωση φρουκτόζης 104.5 g/L και γλυκόζης 25.0 g/L. Το υδρόλυμα αυτό χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για να μελετηθεί η χημική αφυδάτωση των σακχάρων σε HMF με όξινους διαλύτες. Από όλους τους διαλύτες που δοκιμάστηκαν, ο καλύτερος βρέθηκε να είναι το φορμικό οξύ (3.5% v/v) οδηγώντας στην παραγωγή HMF με εκλεκτικότητα 55.8%. Στο επόμενο στάδιο της διατριβής, δείγματα οξιάς και πεύκου προκατεργάστηκαν μέσω της διεργασίας OxiOrganosolv με την προσθήκη πολυοξομεταλλικών καταλυτών στο διαλύτη της προκατεργασίας, με στόχο να μελετηθεί τόσο η επίδραση του τύπου της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας ως αρχική τροφοδοσία, όσο και η προσθήκη του καταλύτη σε διάφορα συστήματα οργανικών διαλυτών. Συγκεκριμένα, οι οργανικοί διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι EtOH, ACO, THF καθώς και η ισοβουτανόλη (iBuOH), ενώ οι πολυοξομεταλλικοί καταλύτες ήταν το εμπορικά διαθέσιμο φωσφομολυβδικό οξύ H3PMo12O40 x H2O (HPMo), καθώς και οι τροποποιημένοι με προσθήκη μετάλλων καταλύτες FePMo and CuPMo. Το καλύτερο δείγμα οξιάς οδήγησε στην παραγωγή 54.9 g φρουκτόζης/ 100 g προκατεργασμένης βιομάζας, ενώ το καλύτερο δείγμα πεύκου σε 53.4 g φρουκτόζης/ 100 g προκατεργασμένης βιομάζας, αντίστοιχα, και τα δύο για προκατεργασία με iBuOH στους 175 oC για 120 min απουσία καταλύτη. Στη συνέχεια, τα καλύτερα δείγματα υπέστησαν χημειοκαταλυτική αφυδάτωση με φορμικό οξύ (3.5% v/v) οδηγώντας στην παραγωγή HMF με εκλεκτικότητα 49.9%. Στο τρίτο στάδιο της διδακτορικής διατριβής, στελέχη αραβοσίτου προκατεργάστηκαν με χρήση μικροκυμάτων σαν πηγή θέρμανσης με σκοπό να συγκριθεί αυτός ο μηχανισμός θέρμανσης με τον παραδοσιακό μηχανισμό θέρμανσης με αντιστάσεις. Τα πειράματα αυτά έλαβαν χώρα στους 150 οC με ένα μείγμα νερού και ACO, προσθέτοντας οξικό οξύ ως καταλύτη. Δέκα διαφορετικές δοκιμές έλαβαν χώρα με σκοπό να εξεταστεί η επίδραση της συγκέντρωσης οξικού οξέος και χρόνου προκατεργασίας στα δείγματα, ενώ η αξιολόγηση της επίδρασης της προκατεργασίας ως προς την ικανότητα σακχαροποίησης του στερεού κλάσματος που προέκυψε, πραγματοποιήθηκε με πειράματα ενζυμικής υδρόλυσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως το καλύτερο υλικό ήταν αυτό που προκατεργάστηκε με συγκέντρωση οξικού οξέος 0.5% v/v για 120 min. Προς χάριν σύγκρισης, ακολούθησε προκατεργασία του ίδιου υλικού σε αυτόκαυστο στις ίδιες συνθήκες. Τα δείγματα που προήλθαν από προκατεργασία με μικροκύματα και σε αυτόκαυστο, εν τέλει υπέστησαν ενζυμική υδρόλυση και ισομερείωση παράγοντας 28.4 και 28.7 g φρουκτόζης/ 100 g προκατεργασμένης βιομάζας, αντίστοιχα. Ωστόσο, οι χρόνοι προκατεργασίας ανάμεσα στις δύο μεθόδους έδειξαν διαφορά 1 h σε διάρκεια, αναδεικνύοντας τη δυνατότητα των μικροκυμάτων να πετύχουν ίδια αποτελέσματα με την παραδοσιακή προκατεργασία σε λιγότερο χρόνο. Τέλος, με στόχο την ανακάλυψη νέων βιοκαταλυτών για τη βιομετατροπή των ενώσεων φουρανίων προς μονομερείς ενώσεις υψηλής προστιθέμενης αξίας, μελετήθηκε μια πρωτεΐνη με ενεργότητα οξειδάσης της γαλακτόζης από το μύκητα F. Oxysporum. Το εν λόγω ένζυμο επιλέχθηκε αναζητώντας οξειδωτικά ένζυμα με ενεργότητα σε φουράνια που ανήκουν στην οικογένεια ΑΑ5_2 της βάσης δεδομένων της CAZy. Το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη απομονώθηκε από το DNA του μικροοργανισμού με χρήση μοριακών τεχνικών και παράχθηκε μέσω ετερόλογης έκφρασης σε κύτταρα Pichia pastoris X33. Κατόπιν προσδιορισμού των ιδανικών συνθηκών λειτουργίας του, αποδείχθηκε πως το ένζυμο ήταν ικανό να πραγματοποιήσει αποτελεσματικά την οξείδωση του HMF καθώς και των οξειδωμένων παραγώγων αυτού, αποδεικνύοντας πως μια ολοκληρωμένη χημειο-ενζυμική διεργασία για την παραγωγή οξειδωμένων μονομερών φουρανίων από τη λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα είναι εφικτή.