Ανάκτηση βιοδραστικών ουσιών από φύκη με χρήση πράσινων τεχνολογιών

Abstract

The ever-growing demand for natural bioactive products coupled with modern requirements for the protection of human well-being and the environment underscores not only the necessity of renewable natural resource exploitation but also the utilization of extraction methodologies that align with criteria related to the protection and preservation of human health and the ecosystem. The biomass of microalgae offers promising natural resource potential for recovering bioactive compounds with diverse applications across industries, such as food, cosmetics, pharmaceuticals etc. Moreover, in addition to conventional extraction approaches, the application of alternative methods has gained significant attention, aiming to curtail the energy cost and the environmental burden. Notably, microwave-assisted extraction and supercritical fluid extraction have emerged as leading methods among the alternative technologies. The present study focused on the recovery of bioactive components from the microalgae Chlorella vulgaris (C. vulgaris) and Scenedesmus obliquus (S. obliquus). While the former is already commercially produced and exploited, the latter one is only being studied holding, however, substantial prospects. This endeavor was achieved through the following green extraction methods: (a) conventional solid-liquid extraction (SLE) with aq. ethanol, 90% v/v, for comparison purposes, (b) microwave-assisted extraction (MAE) with aq. ethanol, 90% v/v, and (c) supercritical fluid extraction (SFE) with carbon dioxide (CO2). The examined methods were systematically evaluated in terms of their yield, the extracts’ phenolic, chlorophyll, and carotenoid – with particular interest in astaxanthin, lutein, and β-carotene – content, and antioxidant activity. A parameter study was conducted including the effect of important extraction parameters, such as temperature, 30-60 oC, time, 6-24 h, and solvent-to-biomass ratio, 20-90 mLsolv/gbiom, for SLE, temperature, 40-60 oC, time, 5-25 min, solvent-to-biomass ratio, 20-90 mLsolv/gbiom, and microwave power, 300-800 W, for MAE, and temperature, 40-60 oC, pressure, 110-250 bar, solvent flow rate, 20-40 gsolv/min, as well as the cosolvent presence (ethanol 10% w/w) for SFE by applying suitable experimental designs. Statistical data analysis and correlation followed, leading to optimization of the extraction conditions regarding yield and extract quality. Moreover, the particular interest on SFE encouraged the kinetic study of the method and, subsequently, the application of a suitable model for the description of the experimental data under the examined conditions. For this purpose, the Broken and Intact Cell Model, also known as Sovová model, was selected, which is based on differential biomass balances. In the case of C. vulgaris, temperature emerged as the primary positive factor affecting SLE’s yield, yet it exerted a negative influence on extract’s antioxidant activity. The temperature increase, while enhancing solvent solubility, is also associated with alteration and degradation phenomena of the bioactive compounds. In addition, the factor of solvent-to-biomass ratio presented the most significant negative effect on extract’s chlorophyll and carotenoid content. The solvent-to-biomass ratio increase enhances the solvent-biomass concentration gradient, providing accelerated extraction of both the targeted and a multitude of additional components, which seemingly reduces the concentration of the former in the extract. Notably, while extraction time was not an equally dominant factor statistically, its interaction with temperature and solvent-to-biomass ratio significantly affected the examined responses, determining the optimal extraction conditions as follows: 30 °C, 24 h and 37 mLsolv/gbiom. Regarding MAE, solvent-to-biomass ratio emerged as the primary positive factor affecting yield, yet it exerted a negative influence on extract’s total chlorophyll and carotenoid content. Moreover, temperature proved to be the most significant factor with negative effect on extract’s antioxidant activity, while presenting a complex effect on extraction yield due to the simultaneous change of microwave power. The combined effect of temperature with the microwave power and solvent-to-biomass ratio were also proved to be significant and complex for the extract’s chlorophyll content. Desirable results regarding the yield and extract’s quality were achieved during extraction under elevated temperature and low microwave power or rapid extraction under low temperature and solvent-to-biomass, and high microwave power. Therefore, the optimal conditions were determined as follows: 60 °C, 14 min, 22 mLsolv/gbiom, and 300 W. Concerning SFE, pressure emerged as the primary positive factor affecting yield, and extract’s carotenoid content and antioxidant activity. Indeed, pressure elevation increases the density of CO2, improves its dissolving ability, and, therefore, favors the extraction of bioactive compounds. The factor of temperature presented a more complex behavior, although its effect was less statistically significant. Temperature increase is associated with both the decrease of CO2 density and the vapor pressure increase of the extractable compounds. At low pressure levels, the decreased density dominated over the increased vapor pressure, while the pressure increase smoothed out the effect of those two phenomena. Additionally, solvent’s flow rate was not considered a statistically significant factor. However, its increase improved extract’s quality by diminishing the mass transfer resistance and, thereby, facilitating the extraction of bioactive compounds. Therefore, the optimal conditions were determined as follows: 60 °C, 250 bar and 40 gsolv/min. Furthermore, the cosolvent (ethanol 10% w/w) addition improved both the yield and extract’s quality compared to pure CO2 due to the alteration of solvent’s polarity, which enabled the coextraction of more polar bioactive components. Finally, successful modelling of SFE’s kinetic experimental data was achieved through the Sovová model with pertinent assumptions made. SFE modelling led to the determination of useful terms under the examined conditions, such as the mass transfer coefficients in the solid and liquid phase. Following extraction optimization, a comprehensive comparison was performed between the examined methods. Firstly, SLE presented the highest yield, yet led to a carotenoid-poor extract with the weakest antioxidant activity. The application of MAE drastically reduced the extraction duration, while presenting appreciable yield and superior extract quality in contrast to SLE. In addition, the application of SFE, although presented the lowest yield and chlorophyll content, led into an improved extract regarding phenolic and carotenoid content, and antioxidant activity compared to SLE and MAE. The addition of ethanol, 10% w/w, during SFE doubled the extraction yield and overall improved extract’s bioactive content and antioxidant activity. Therefore, while the conventional SLE presented the highest yield, the application of the alternative MAE and SFE proved to be promising methods leading to improved extracts of superior quality and stronger antioxidant activity. The bioactivity of the obtained microalgal extracts was also proved by preliminary findings which demonstrated that C. vulgaris extracts (SLE and SFE) could provide antioxidant defense to human mesenchymal stem cells from adipose tissue (hMSC-AT). In fact, SFE extract offered the strongest antioxidant. In the case of S. obliquus, temperature demonstrated a positive influence on SLE’s yield, although decreasing extract’s carotenoid content. Furthermore, the combination of temperature and time emerged as the primary negative factor affecting extract’s phenolic and chlorophyll content, and antioxidant activity. The factor of solvent-to-biomass ratio presented a complex influence depending on temperature and duration values, yet lacked statistical significance for most of the responses. The optimal extraction conditions were determined as follows: 30 °C, 24 h and 90 mLsolv/gbiom. Likewise, the temperature increase mainly favored MAE’s yield, while the combined effect of extraction temperature and duration proved to be the most significant negative factor for extract’s antioxidant activity. The extraction duration, solvent-to-biomass ratio, and microwave power demonstrated a more complex behavior, determining the optimal extraction conditions as follows: 60 °C, 5 min and 90 mLsolv/gbiom, and 300 W. Regarding SFE, temperature proved to be the main positive factor affecting yield. However, mainly the increase of pressure improved extract’s bioactive content and antioxidant activity. In addition, the factor of solvent’s flow rate, though not statistically significant, presented a positive effect under elevated temperature and pressure values. Similar to the SFE of C. vulgaris, the optimal conditions were determined as follows: 60 °C, 250 bar and 40 gsolv/min. Moreover, the addition of a polar cosolvent (ethanol 10% w/w) once again improved SFE’s yield and extract’s quality in contrast to pure CO2. Finally, the Sovová model accompanied with pertinent assumptions successfully described SFE’s kinetic experimental data, determining useful terms under the examined conditions, such as the mass transfer coefficients in the solid and liquid phase. Subsequently, the comparison of the examined methods for S. obliquus extraction proved that SLE provided an extract with the lowest carotenoid content and the weakest antioxidant activity. The application of MAE, however, significantly shortened the extraction duration, while improving extract’s yield, bioactive content, and antioxidant activity compared to SLE. Additionally, the application of SFE, although associated with lower yield, and decreased phenolic and chlorophyll content, led into improved carotenoid content and antioxidant activity in contrast to SLE and MAE. Furthermore, the addition of ethanol, 10% w/w, during SFE significantly increased the extraction yield to levels competitive with SLE, and overall enhanced extract’s quality compared to the cosolvent absence, but also the case of SLE and MAE. Therefore, the non-conventional MAE – with the highest yield – and SFE led to superior extracts in terms of bioactive content and antioxidant activity compared to SLE, and proved to be two promising alternative extraction methods. Finally, a Life Cycle Analysis (LCA) of the examined extraction methods was conducted in order to evaluate their environmental footprint in recovering bioactive compounds from C. vulgaris and S. obliquus. In both microalgae cases, LCA indicated the significant contribution of energy-intensive processes to the environmental footprint, such us such as extraction heating and solvent recovery for SLE, microwave application for MAE, and solvent cooling and compression for SFE. Moreover, the assessment of the examined environmental indicators revealed that in the case of C. vulgaris, the improved environmental footprint of SFE was followed by SLE’s and MAE’s environmental footprint. Similarly, SFE led to the most favorable environmental footprint for S. obliquus, followed by ΜΑΕ and SLE. In conclusion, the application of MAE and SFE for microalgae extraction leads to the recovery of competitive products, which demonstrate superior quality in terms of bioactive content and antioxidant activity in contrast to SLE. Additionally, the application of SFE for C. vulgaris, and MAE and SFE for S. obliquus is characterized by a reduced environmental impact. Therefore, the utilization of the proposed non-conventional extraction methods, and especially SFE, for the recovery of high-added value bioactive compounds from the alternative biomass of microalgae is considered a promising application. Hence, the present comprehensive study provides useful information for the investigation and subsequent design of the aforementioned processes.

Η συνεχώς αυξανόμενη ζήτηση για φυσικά βιοδραστικά προϊόντα σε συνδυασμό με τις σύγχρονες απαιτήσεις για την προστασία του ανθρώπου και του περιβάλλοντος υπογραμμίζουν όχι μόνο την αναγκαιότητα εκμετάλλευσης ανανεώσιμων φυσικών πρώτων υλών, αλλά και την αξιοποίηση μεθόδων εκχύλισης οι οποίες πληρούν τις προϋποθέσεις που αφορούν στην προστασία και τη διατήρηση της ανθρώπινης υγείας και του οικοσυστήματος. Η βιομάζα των μικροφυκών παρουσιάζει σημαντικές προοπτικές ως πρώτη ύλη όσον αφορά στην ανάκτηση βιοδραστικών ουσιών με δυνατότητες εφαρμογής στη βιομηχανία τροφίμων, καλλυντικών, φαρμάκων κ.α. Επιπλέον, πέρα από τις συμβατικές μεθόδους εκχύλισης των εν λόγω συστατικών, ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχουν αποκτήσει οι εναλλακτικές μέθοδοι εκχύλισης, στοχεύοντας στη μείωση τόσο του ενεργειακού κόστους όσο και των περιβαλλοντικών επιπτώσεων. Ανάμεσα στις πιο δημοφιλείς μεθόδους συγκαταλέγονται η υποβοηθούμενη εκχύλιση με μικροκύματα και η υπερκρίσιμη εκχύλιση. Η παρούσα διατριβή αποσκοπεί στην ανάκτηση βιοδραστικών συστατικών από τα μικροφύκη Chlorella vulgaris (C. vulgaris) και Scenedesmus obliquus (S. obliquus). Το πρώτο είναι ένα αντιπροσωπευτικό είδος το οποίο μελετάται, παράγεται και αξιοποιείται ήδη εμπορικά, ενώ το δεύτερο είναι ένα είδος το οποίο, εξαιτίας των σημαντικών προοπτικών του, έχει προσελκύσει το έντονο ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας. Η εν λόγω ανάκτηση επετεύχθη εφαρμόζοντας τις εξής πράσινες μεθόδους εκχύλισης: (α) συμβατική εκχύλιση στερεού-υγρού (SLE) με μίγμα αιθανόλης/νερού, 90/10 κ.ο., για λόγους σύγκρισης, (β) υποβοηθούμενη εκχύλιση με μικροκύματα (MAE) και διαλύτη μίγμα αιθανόλης/νερού, 90/10 κ.ο., και (γ) υπερκρίσιμη εκχύλιση (SFE) με διοξείδιο του άνθρακα (CO2). Οι μέθοδοι αξιολογήθηκαν ως προς την απόδοσή τους, την περιεκτικότητα των εκχυλισμάτων σε φαινολικά συστατικά, χλωροφύλλες και καροτενοειδή, με ιδιαίτερο ενδιαφέρον στην ασταξανθίνη, τη λουτεΐνη και το β-καροτένιο, και την αντιοξειδωτική τους δράση. Ειδικότερα, μελετήθηκε η επίδραση σημαντικών παραμέτρων, όπως η θερμοκρασία, 30-60 oC, ο χρόνος, 6-24 h, και η αναλογία διαλύτη/βιομάζας, 20-90 mLsolv/gbiom για την SLE, η θερμοκρασία, 40-60 oC, ο χρόνος, 5-25 min, η αναλογία διαλύτη/βιομάζας, 20-90 mLsolv/gbiom, και ισχύς των μικροκυμάτων, 300-800 W, για τη ΜΑΕ, και η θερμοκρασία, 40-60 oC, η πίεση, 110-250 bar, ο ρυθμός ροής του διαλύτη, 20-40 gsolv/min, καθώς και η παρουσία συνδιαλύτη, αιθανόλη 10% κ.β., για την SFE με την εφαρμογή κατάλληλου πειραματικού σχεδιασμού. Ακολούθησε στατιστική επεξεργασία των δεδομένων, συσχέτιση μεταξύ των ανεξάρτητων (παράμετροι εκχύλισης) και εξαρτημένων μεταβλητών (εξεταζόμενες αποκρίσεις), και βελτιστοποίηση των συνθηκών εκχύλισης με κριτήριο τόσο την απόδοση όσο και την ποιότητα των εκχυλισμάτων. Στη συνέχεια, δίνοντας ιδιαίτερη βαρύτητα στην υπερκρίσιμη εκχύλιση, διεξήχθη κινητική μελέτη της μεθόδου και επιχειρήθηκε η περιγραφή των πειραματικών δεδομένων στις εξεταζόμενες συνθήκες εφαρμόζοντας το μοντέλο των κατεστραμμένων και μη κυτταρικών δομών (Broken and Intact Cell Model) ή αλλιώς μοντέλο Sovová, το οποίο βασίζεται στην επίλυση διαφορικών ισοζυγίων μάζας. Στην περίπτωση του μικροφύκους C. vulgaris, η θερμοκρασία αποτέλεσε τον σημαντικότερο παράγοντα θετικής επίδρασης για την απόδοση της SLE, και αρνητικής επίδρασης για την αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος. Η αύξηση της θερμοκρασίας, παρότι βελτιώνει τη διαλυτική ικανότητα του διαλύτη, συνδέεται με φαινόμενα αλλοίωσης και υποβάθμισης των θερμοευαίσθητων βιοδραστικών συστατικών. Επιπλέον, η αναλογία διαλύτη/βιομάζας αποτέλεσε τον σημαντικότερο παράγοντα αρνητικής επίδρασης για την περιεκτικότητα του εκχυλίσματος σε χλωροφύλλες και καροτενοειδή. Η αύξηση της αναλογίας ενισχύει τη βαθμίδα συγκέντρωσης του συστήματος διαλύτη-βιομάζας, συμβάλλοντας στην ταχύτερη εκχύλιση τόσο των εξεταζόμενων όσο και πληθώρας πρόσθετων συστατικών, μειώνοντας φαινομενικά τη συγκέντρωση των πρώτων στο εκχύλισμα. Τέλος, ο χρόνος εκχύλισης δεν αποτέλεσε εξίσου στατιστικά σημαντικό παράγοντα. Ωστόσο, η συνδυαστική του μεταβολή με τη θερμοκρασία και την αναλογία διαλύτη/βιομάζας επηρέασε σημαντικά τις εξεταζόμενες αποκρίσεις, διαμορφώνοντας τις βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης ως εξής: 30 °C, 24 h και 37 mLsolv/gbiom. Αναφορικά με τη ΜΑΕ, η παράμετρος αναλογίας διαλύτη/βιομάζας αποδείχθηκε ο πιο σημαντικός παράγοντας θετικής επίδρασης για την απόδοση, και αρνητικής επίδρασης για την περιεκτικότητα του εκχυλίσματος σε χλωροφύλλες και ολικά καροτενοειδή. Ταυτόχρονα, η θερμοκρασία αποτέλεσε τον σημαντικότερο παράγοντα αρνητικής επίδρασης για την αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος, και σύνθετης επίδρασης για την απόδοση εξαιτίας της ταυτόχρονης μεταβολής της ισχύος. Εξίσου σημαντική για τη συγκέντρωση των χλωροφυλλών προέκυψε η συνδυαστική επίδραση της θερμοκρασίας με την ισχύ και την αναλογία διαλύτη/βιομάζας. Επιθυμητά αποτελέσματα απόδοσης και ποιότητας του εκχυλίσματος προέκυψαν σε εκχυλίσεις υπό υψηλή θερμοκρασία και χαμηλή ισχύ ή σύντομες εκχυλίσεις υπό χαμηλή θερμοκρασία και αναλογία διαλύτη/βιομάζας, και υψηλή ισχύ. Τελικά, οι βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης διαμορφώθηκαν ως εξής: 60 °C, 14 min, 22 mLsolv/gbiom, και 300 W. Σχετικά με την SFE, η αύξηση της πίεσης αποδείχθηκε ο σημαντικότερος παράγοντας θετικής επίδρασης για την απόδοση, την περιεκτικότητα του εκχυλίσματος σε καροτενοειδή και την αντιοξειδωτική του δράση. Πράγματι, η αύξηση της πίεσης αυξάνει την πυκνότητα του CO2 και βελτιώνει τη διαλυτική του ικανότητα, ευνοώντας την εκχύλιση των βιοδραστικών συστατικών. Η θερμοκρασία παρουσίασε μια πιο σύνθετη συμπεριφορά, ωστόσο, δεν προέκυψε εξίσου στατιστικά σημαντικός παράγοντας. Η αύξηση της θερμοκρασίας συνδέεται με τη μείωση της πυκνότητας του CO2 και κατ’ επέκταση τη μείωση της διαλυτικής του ικανότητας, και ταυτόχρονα την αύξηση της τάσης ατμών των προς εκχύλιση συστατικών. Στις χαμηλές πιέσεις η μείωση της πυκνότητας κυριάρχησε έναντι της αυξημένης τάσης ατμών, γεγονός το οποίο δεν ευνόησε την εκχύλιση, ενώ η αύξηση της πίεσης εξομάλυνε τα δύο παρατηρούμενα φαινόμενα. Ακόμη, ο ρυθμός ροής του CO2 δεν προέκυψε στατιστικά σημαντικός παράγοντας επίδρασης. Ωστόσο, η αύξησή του βελτίωσε την ποιότητα του εκχυλίσματος, πιθανότατα εξαιτίας της μειωμένης αντίστασης της μεταφοράς μάζας, η οποία διευκόλυνε την εκχύλιση των βιοδραστικών συστατικών. Συνεπώς, οι βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης διαμορφώθηκαν ως εξής: 60 °C, 250 bar και 40 gsolv/min. Επιπλέον, η προσθήκη συνδιαλύτη (αιθανόλη 10% κ.β.) βελτίωσε την απόδοση και την ποιότητα του εκχυλίσματος σε σύγκριση με τη χρήση του καθαρού CO2, καθώς μετέβαλε την πολικότητα του διαλύτη και επέτρεψε τη συνεκχύλιση περισσότερων πολικών βιοδραστικών συστατικών. Τέλος, η μοντελοποίηση της SFE διεξήχθη επιτυχώς με την εφαρμογή του μοντέλου Sovová και τη χρήση κατάλληλων παραδοχών, προσδιορίζοντας χρήσιμα μεγέθη στις εξεταζόμενες συνθήκες, όπως οι συντελεστές μεταφοράς μάζας στη στερεή και τη ρευστή φάση. Τη βελτιστοποίηση των μεθόδων εκχύλισης ακολούθησε η μεταξύ τους σύγκριση. Από τη σύγκριση προέκυψε ότι η SLE, παρά την υψηλή απόδοση, οδήγησε στη λήψη εκχυλίσματος με μειωμένη συγκέντρωση σε καροτενοειδή και λιγότερο ισχυρή αντιοξειδωτική δράση. Η εφαρμογή της ΜΑΕ μείωσε σημαντικά τον χρόνο εκχύλισης οδηγώντας σε μια αξιόλογη απόδοση, και ένα ανώτερης ποιότητας εκχύλισμα σε σύγκριση με την SLE. Επιπλέον, η εφαρμογή της SFE οδήγησε σε χαμηλή απόδοση και συγκέντρωση χλωροφυλλών. Ωστόσο, προέκυψε ένα βελτιωμένο εκχύλισμα αναφορικά με την περιεκτικότητα φαινολικών συστατικών και καροτενοειδών, και την αντιοξειδωτική του δράση σε σύγκριση με τις SLE και ΜΑΕ. Η προσθήκη συνδιαλύτη (αιθανόλη 10% κ.β.) κατά την SFE διπλασίασε την απόδοση και βελτίωσε συνολικά την περιεκτικότητα σε βιοδραστικά συστατικά και την αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος. Επομένως, αν και η συμβατική SLE παρουσίασε την υψηλότερη απόδοση, η εφαρμογή των εναλλακτικών ΜΑΕ και SFE αποδείχθηκε πολλά υποσχόμενη οδηγώντας στη λήψη βελτιωμένων εκχυλισμάτων ανώτερης ποιότητας και πιο ισχυρής αντιοξειδωτικής δράσης. Το συμπέρασμα της λήψης βιοδραστικών εκχυλισμάτων ενισχύθηκε και από προκαταρκτικά ευρήματα τα οποία απέδειξαν ότι τα εκχυλίσματα C. vulgaris (SLE και SFE) παρείχαν αντιοξειδωτική άμυνα σε ανθρώπινα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα από λιπώδη ιστό (hMSC-AT). Την ισχυρότερη, μάλιστα, αντιοξειδωτική δράση παρουσίασε το εκχύλισμα της SFE. Αναφορικά με το μικροφύκος S. obliquus, η αύξηση της θερμοκρασίας επηρέασε κυρίως την απόδοση της SLE με θετικό πρόσημο, μειώνοντας, ωστόσο, τη συγκέντρωση των καροτενοειδών. Επιπλέον, η συνδυαστική επίδραση θερμοκρασίας και χρόνου αποδείχθηκε η πιο σημαντική παράμετρος για τη συγκέντρωση των φαινολικών συστατικών και των χλωροφυλλών, και της αντιοξειδωτικής δράσης του εκχυλίσματος με αρνητικό πρόσημο. Η αύξηση της αναλογίας διαλύτη/βιομάζας επέφερε είτε θετική είτε αρνητική επίδραση, ανάλογα με τις τιμές της θερμοκρασίας και του χρόνου εκχύλισης, ωστόσο, δεν αποτέλεσε στατιστικά σημαντική παράμετρο για τις περισσότερες αποκρίσεις. Σε αυτήν την περίπτωση, οι βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης διαμορφώθηκαν ως εξής: 30 °C, 24 h και 90 mLsolv/gbiom. Ομοίως και για τη ΜΑΕ, η αύξηση της θερμοκρασίας ευνόησε κυρίως την απόδοση, ενώ η συνδυαστική επίδραση της θερμοκρασίας με τον χρόνο εκχύλισης αποδείχθηκε ο πιο καθοριστικός παράγοντας για την αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος επηρεάζοντάς την αρνητικά. Ο χρόνος εκχύλισης, η αναλογία διαλύτη/βιομάζας και η ισχύς των μικροκυμάτων παρουσίασαν μια πιο σύνθετη επίδραση, διαμορφώνοντας τις βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης ως εξής: 60 °C, 5 min, 90 mLsolv/gbiom, και 300 W. Αναφορικά με την SFE, η θερμοκρασία αποτέλεσε τον πιο σημαντικό παράγοντα θετικής επίδρασης στην απόδοση. Ωστόσο, η αύξηση της πίεσης συνέβαλε κυρίως στη βελτίωση του εκχυλίσματος αναφορικά με την περιεκτικότητα των εξεταζόμενων βιοδραστικών συστατικών και την αντιοξειδωτική του δράση. Επιπλέον, ο ρυθμός ροής του CO2 δεν προέκυψε στατιστικά σημαντικός παράγοντας επίδρασης, βελτιώνοντας, ωστόσο, τα αποτελέσματα στις υψηλές τιμές θερμοκρασίας και πίεσης. Όμοια με την περίπτωση του C. vulgaris, οι βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης διαμορφώθηκαν ως εξής: 60 °C, 250 bar και 40 gsolv/min. Ακόμη, η προσθήκη αιθανόλης, 10% κ.β., βελτίωσε και πάλι την απόδοση και την ποιότητα του εκχυλίσματος σε σύγκριση με τη χρήση μόνο του CO2. Τέλος, η εφαρμογή του μοντέλου Sovová διεξήχθη επιτυχώς με τη χρήση κατάλληλων παραδοχών, οδηγώντας στη μοντελοποίηση της SFE του S. obliquus και παρέχοντας χρήσιμες πληροφορίες για τους συντελεστές μεταφοράς μάζας. Ακολούθως, η σύγκριση των μεθόδων για την περίπτωση του S. obliquus απέδειξε, αρχικά, ότι η SLE οδήγησε στη λήψη ενός εκχυλίσματος με χαμηλή συγκέντρωση καροτενοειδών και λιγότερο ισχυρή αντιοξειδωτική δράση. Η ΜΑΕ, από την άλλη, μείωσε εξαιρετικά τον χρόνο εκχύλισης βελτιώνοντας, ταυτόχρονα, την απόδοση, την περιεκτικότητα του εκχυλίσματος σε όλα τα εξεταζόμενα βιοδραστικά συστατικά, και την αντιοξειδωτική του δράση σε σύγκριση με την SLE. Επιπλέον, η SFE συνδέθηκε με χαμηλότερες τιμές απόδοσης και συγκέντρωσης του εκχυλίσματος σε φαινολικά συστατικά και χλωροφύλλες, παρουσιάζοντας, ωστόσο, υψηλότερη συγκέντρωση σε καροτενοειδή και ισχυρότερη αντιοξειδωτική δράση σε σύγκριση με τις SLE και ΜΑΕ. Τέλος, η προσθήκη της αιθανόλης κατά την SFE αύξησε σημαντικά την απόδοση σε συναγωνίσιμα επίπεδα με αυτά της SLE, και βελτίωσε συνολικά την ποιότητα του παραγόμενου προϊόντος σε σύγκριση με την απουσία συνδιαλύτη αλλά και τις SLE και ΜΑΕ. Συνεπώς, η ΜΑΕ, με την υψηλότερη απόδοση, και η SFE αποδείχθηκαν πολλά υποσχόμενες μέθοδοι οδηγώντας στη λήψη προϊόντων ανώτερης ποιότητας και αντιοξειδωτικής δράσης σε σύγκριση με την SLE. Η διατριβή ολοκληρώνεται με την Ανάλυση Κύκλου Ζωής (Life Cycle Analysis – LCA) των τριών εξεταζόμενων μεθόδων για την ανάκτηση βιοδραστικού εκχυλίσματος από τα μικροφύκη C. vulgaris και S. obliquus, με στόχο την αξιολόγηση του περιβαλλοντικού τους αποτυπώματος. Και στις δύο περιπτώσεις, η LCA υπέδειξε τη σημαντική συνεισφορά των διεργασιών υψηλής κατανάλωσης ενέργειας στο περιβαλλοντικό αποτύπωμα, όπως είναι η θέρμανση εκχύλισης και η ανάκτηση των διαλυτών για την SLE, η εφαρμογή των μικροκυμάτων για τη ΜΑΕ, και η ψύξη και συμπίεση του διαλύτη για την SFE. Επιπλέον, από την αξιολόγηση των περιβαλλοντικών δεικτών προέκυψε ότι στην περίπτωση του μικροφύκους C. vulgaris, η SFE οδηγεί σε βελτιωμένο περιβαλλοντικό αποτύπωμα, ακολουθούμενη από την SLE και τη ΜΑΕ. Αναφορικά με το μικροφύκος S. obliquus, η SFE οδήγησε και πάλι σε βελτιωμένο περιβαλλοντικό αποτύπωμα, ακολουθούμενη από τη ΜΑΕ και την SLE. Συμπερασματικά, η εφαρμογή των μεθόδων ΜΑΕ και SFE στα μικροφύκη οδηγεί στην ανάκτηση ανταγωνιστικών προϊόντων, τα οποία παρουσιάζουν ανώτερη ποιότητα αναφορικά με τη σύστασή τους σε βιοδραστικά συστατικά και την αντιοξειδωτική τους δράση σε σύγκριση με την SLE. Επιπλέον, η εφαρμογή της SFE για το C. vulgaris, και των ΜΑΕ και SFE για το S. obliquus, χαρακτηρίζεται από μειωμένο περιβαλλοντικό αποτύπωμα έναντι της SLE. Συνεπώς, η αξιοποίηση των προτεινόμενων μη συμβατικών μεθόδων διαχωρισμού, και κυρίως της SFE, στην ανάκτηση βιοδραστικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας από την εναλλακτική πρώτη ύλη των μικροφυκών αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη εφαρμογή, και η παρούσα συγκριτική μελέτη παρέχει χρήσιμες πληροφορίες για τη διερεύνηση και τον μετέπειτα σχεδιασμό των εν λόγω διεργασιών.