Delineation of the molecular basis of sexual dimorphism in autoimmunity

Abstract

Autoimmunity is characterized by acute immune responses against self-organs. Noteworthy and still puzzling is the fact that autoimmune diseases are more prevalent in women than men. This is best exemplified in the case of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) that displays a striking female predominance of almost 10:1. By performing an unbiased whole blood transcriptome analysis in SLE patients and healthy individuals, we have demonstrated that SMC1A, a cohesin complex member located on X chromosome, displays a strong female-biased expression pattern. Following this analysis, we herein uncover that SMC1A shows augmented female expression both in SLE patient monocytes as well as in monocytes cultured under lupus-inducing conditions. To address the role of SMC1A/cohesin in the context of SLE, we employed chromatin immunoprecipitation in combination with next generation sequencing (ChIP-seq) and transcriptome screening approaches in monocytes cultured under lupus-inducing conditions. Under lupus-like conditions, SMC1A was repositioned at the enhancers of genes belonging to major inflammatory pathways such as cytokine production and T-cell activation. The binding of SMC1A at genomic enhancers coincided with heightened chromatin accessibility (as revealed by ATAC-seq) and increased deposition of histone modifications indicative of active transcription (as seen in H3K27ac, H3K4me3 and H4ac ChIP-seq) at the specific regions. Additionally, this correlated with the transcriptional activation of the corresponding genes, therefore suggesting a putative role of SMC1A in regulating major inflammatory genes. In agreement, SMC1A-silenced SLE-like monocytes exhibited decreased mRNA and protein expression of disease-related inflammatory molecules, exemplified by IL-6 and IL-1A. These two genes were direct targets of SMC1A and notably, we revealed that they exhibit higher expression levels in female versus male SLE-like monocytes, as a result of augmented SMC1A binding at the corresponding gene enhancers in the female group. Importantly, transcriptome profiling of monocytes derived from SLE patients revealed increased expression of several SMC1A-regulated genes associated with activation of inflammatory response in female compared to male patients. Overall, the results highlight a unique role of SMC1A as a female-biased gene that regulates key inflammatory pathways upon lupus-like inflammation, linking this structural maintenance protein involved in chromosomal processes with female predominance in SLE disease. To gain further insights into the molecular correlates of sex differences in autoimmunity, we performed a comprehensive analysis of sex-associated differential splicing events in a dataset of whole blood samples derived from 79 active SLE patients and 58 healthy individuals. Sex differences in splicing events were widespread, existent both in SLE and healthy state. Nonetheless, we observed distinct gene sets and molecular pathways targeted by sex-dependent alternative splicing in SLE patients as compared to healthy subjects. Sexually differential spliced genes specific to SLE were enriched for dynamic cellular processes including chromatin remodeling, stress and inflammatory responses. These results align with the aforementioned findings pertaining to SMC1A, member of the chromatin remodeling complex “cohesin”, suggesting a potential crucial involvement of chromatin remodeling process in sexual dimorphism of SLE. Collectively, this analysis reveals an unprecedent variation in sex-dependent splicing events in SLE and healthy state, with potential implications to understating the molecular basis of sexual dimorphism in autoimmunity. Finally, we report on a young female SLE patient who developed Progressive Multifocal Leukoencephalopathy (PML) while on mild background therapy and we present the diagnostic and therapeutic challenges pertaining to this complication. PML is a severe demyelinating disease of the central nervous system caused by reactivation of the polyomavirus JC (JCV) more frequently in immunocompromised individuals. In an attempt to unravel possible patient- or disease-related liabilities linked to PML, we performed peripheral blood immunophenotyping and analyzed the genetic make-up of the patient by means of whole exome sequencing. Marked B-cell lymphopenia in the peripheral blood and the bone marrow as well as deleterious variants in GATA2 and CDH7 genes were identified, suggesting the possible role of patient-intrinsic risk factors, rather than of drug-induced immunosuppression, in driving immune dysregulation and susceptibility to PML at least in a subset of patients with SLE.

Τα αυτοάνοσα νοσήματα προκαλούνται από απαντήσεις του ανοσοποιητικού συστήματος έναντι αυτοαντιγόνων που οδηγούν σε χρόνια ιστική βλάβη. Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των αυτοάνοσων νοσημάτων είναι ότι εμφανίζονται σε πολύ μεγαλύτερη συχνότητα στις γυναίκες συγκριτικά με τους άντρες. Ειδικά στην περίπτωση του Συστηματικού Ερυθηματώδη Λύκου (ΣΕΛ), η αναλογία γυναίκες: άντρες κυμαίνεται μεταξύ 7:1 έως και 10:1. Από την άλλη, οι άντρες, παρόλο που προσβάλλονται λιγότερο συχνά, παρουσιάζουν πιο σοβαρές εκδηλώσεις της ασθένειας καθώς και αυξημένα επίπεδα μη-αναστρέψιμης βλάβης οργάνων (για παράδειγμα από τους νεφρούς). Συνεπώς, το ΣΕΛ αποτελεί κατάλληλο μοντέλο νόσου για την μελέτη της μοριακής βάσης του φυλετικού διμορφισμού στην ανθρώπινη αυτοανοσία. Η ανάλυση της έκφρασης γονιδίων σε ολόκληρο το γονιδίωμα (genome-wide transcriptomics) αποτελεί μια αμερόληπτη μέθοδο για τη μελέτη πολύπλοκων νοσημάτων και μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην παθογένεια τους. Πρόσφατα, πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριό μας RNA-sequencing σε ολικό αίμα από 148 ασθενείς με ΣΕΛ και 52 υγιείς εθελοντές. Μετά από βιοπληροφορική ανάλυση καταλήξαμε σε μια φύλο-εξαρτώμενη γονιδιακή «υπογραφή» (gene signature), η οποία εντοπίζεται στη νόσο αλλά όχι στους υγιείς εθελοντές. Μεταξύ αυτών των γονιδίων, το SMC1A, το οποίο κωδικοποιεί για την πρωτεΐνη Structural Maintenance of Chromosomes 1A, είχε την στατιστικά σημαντικότερη διαφορά ανάμεσα στις γυναίκες και τους άνδρες ασθενείς. Πιο συγκεκριμένα, οι γυναίκες ασθενείς με ΣΕΛ είχαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου SMC1A συγκριτικά με τους άνδρες ασθενείς. Αναζητώντας τον κυτταρικό πληθυσμό του ανοσοποιητικού που αντικατοπτρίζει καλύτερα την φύλο-εξαρτώμενη έκφραση του γονιδίου SMC1A στο ΣΕΛ, απομονώσαμε από ολικό αίμα νέας ομάδας ασθενών ΣΕΛ και υγιών εθελοντών τους 4 κύριους κυτταρικούς υπό-πληθυσμούς του ανοσοποιητικού, δηλαδή τα CD4+ T-λεμφοκύτταρα, τα CD19+ B-λεμφοκύτταρα, τα CD14+ μονοκύτταρα και τα ουδετερόφιλα και μελετήσαμε την έκφραση του SMC1A (μεταγραφικά και πρωτεϊνικά) με πειράματα αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR) καθώς και ανοσοαποτύπωσης (Western blot). Μεταξύ των κυτταρικών τύπων που μελετήσαμε, τα CD14+ μονοκύτταρα είχαν την σημαντικότερη φύλο-εξαρτώμενη έκφραση του SMC1A στο ΣΕΛ συγκριτικά με την υγιή κατάσταση. Η πρωτεΐνη SMC1A αποτελεί βασικό δομικό συστατικό του συμπλέγματος της κοχεσίνης (cohesin complex) και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω της προεκβολής βρόχων στο DNA και τη δημιουργία σχετιζόμενων μεταγραφικά περιοχών (TADs: topologically associating domains). Αξίζει να σημειωθεί ότι το γονίδιο SMC1A εντοπίζεται στο χρωμόσωμα X και πειραματικά δεδομένα υποστηρίζουν ότι διαφεύγει εν μέρει από την φυσιολογική αποσιώπησή του. Με βάση τα παραπάνω, θελήσαμε να εξετάσουμε τον πιθανό ρόλο του SMC1A/ συμπλέγματος κοχεσίνης στην παθογένεια και τον φυλετικό διμορφισμό της αυτοανοσίας χρησιμοποιώντας το ΣΕΛ ως πρότυπο νόσου. Για τον σκοπό αυτό, πραγματοποιήσαμε πειράματα ανοσοκατακρήμνισης της χρωματίνης σε συνδυασμό με αλληλούχιση επόμενης γενιάς (ChIP sequencing) καθώς και αναλύσεις του μεταγραφώματος σε ενεργοποιημένα μονοκύτταρα που προσομοιάζουν τα μονοκύτταρα ασθενών ΣΕΛ (μονοκύτταρα τύπου ΣΕΛ). Τα αποτελέσματα των πειραμάτων έδειξαν ότι οι θέσεις πρόσδεσης της πρωτεΐνης SMC1A στην χρωματίνη των μονοκυττάρων τύπου ΣΕΛ αλλάζουν δραματικά και η πρωτεΐνη SMC1A αποκτάει επιλεκτικά πρόσδεση στους ενισχυτές σημαντικών γονιδίων φλεγμονής, που συμμετέχουν σε μονοπάτια αυτοανοσίας, όπως η έκκριση κυτταροκινών και η ενεργοποίηση των Τ-λεμφοκυττάρων. Η πρόσδεση της πρωτεΐνης SMC1A στους ενισχυτές συνοδευόταν από την μεταγραφική έκφραση αυτών των γονιδίων. Επιπλέον, πειράματα γονιδιακής αποσιώπησης έδειξαν ότι τα μονοκύτταρα τύπου ΣΕΛ που έχουν ελαττωμένη έκφραση του SMC1A εμφανίζουν μειωμένα επίπεδα έκφρασης και παραγωγής σημαντικών φλεγμονωδών πρωτεϊνών, όπως είναι η ιντερλευκίνη 6 (IL-6) και η ιντερλευκίνη 1A (IL-1A), επιβεβαιώνοντας τον ρόλο της πρωτεΐνης SMC1A να ρυθμίζει γονίδια-κλειδιά στην παθογένεια του ΣΕΛ. Μελετώντας στην συνέχεια τον ρόλο της πρωτεΐνης SMC1A στον φυλετικό διμορφισμό του ΣΕΛ με πειράματα ανάλυσης μεταγραφώματος (Quant-seq) μονοκυττάρων που απομονώσαμε από νέα ομάδα ανδρών και γυναικών ασθενών με ΣΕΛ, διαπιστώσαμε ότι βασικά γονίδια φλεγμονής, τα οποία βρήκαμε ότι ρυθμίζονται από την SMC1A μέσω πρόσδεσης στις ρυθμιστικές περιοχές τους, εμφανίζουν μεγαλύτερα επίπεδα έκφρασης στις γυναίκες συγκριτικά με τους άνδρες ασθενείς με ΣΕΛ. Παράλληλα, με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης της χρωματίνης σε μονοκύτταρα τύπου ΣΕΛ ανδρών και γυναικών εθελοντών, διαπιστώσαμε ότι η έκφραση καθώς και η πρόσδεση της πρωτεΐνης SMC1A είναι αυξημένη στους ενισχυτές των γονιδίων IL-6 και IL-1A στις γυναίκες συγκριτικά με τους άνδρες. Όλα τα παραπάνω αποτελέσματα υποστηρίζουν την σύνδεση της πρωτεΐνης SMC1A με τον φυλετικό διμορφισμό στο ΣΕΛ μέσω ρύθμισης της έκφρασης γονιδίων φλεγμονής καθιστώντας τα μονοκύτταρα των γυναικών ασθενών ΣΕΛ πιο ευαίσθητα σε φλεγμονώδη ερεθίσματα και συνεπώς τις γυναίκες πιο επιρρεπείς στην αυτοανοσία. Η διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών που ευθύνονται για τον φυλετικό διμορφισμό στα αυτοάνοσα νοσήματα είναι απαραίτητη για να κατανοήσουμε καλύτερα την παθογένειά τους, με απώτερο σκοπό την ανάπτυξη νέων/καινοτόμων ή εξατομικευμένων (με βάση το φύλο) θεραπειών. Προκειμένου να μελετήσουμε περαιτέρω την μοριακή βάση του φυλετικού διμορφισμού στην αυτοανοσία, πραγματοποιήσαμε εκτενή ανάλυση των φύλο-εξαρτώμενων συμβάντων εναλλακτικού ματίσματος (alternative splicing events) στο ολικό αίμα της ίδιας κοορτής ασθενών με ΣΕΛ και υγιών εθελοντών που έγινε η μελέτη του μεταγραφώματος. Από την ανάλυση, προέκυψε ένας μεγάλος αριθμός φύλο-εξαρτώμενων συμβάντων εναλλακτικού ματίσματος τόσο στους ασθενείς με ΣΕΛ (ν=428) όσο και στους υγιείς (ν=459). Ωστόσο, τα γονίδια στα οποία αντιστοιχούν τα φύλο-εξαρτώμενα συμβάντα εναλλακτικού ματίσματος συμμετείχαν σε διαφορετικά μοριακά μονοπάτια στους ασθενείς με ΣΕΛ συγκριτικά με τους υγιείς. Επιπλέον, τα φύλο-εξαρτώμενα συμβάντα που εμφανίζονταν αποκλειστικά στους ασθενείς με ΣΕΛ αντιστοιχούν σε γονίδια τα οποία συμμετέχουν σε δυναμικές λειτουργίες του κυττάρου, όπως είναι η αναδιαμόρφωση της χρωματίνης, και η απόκριση σε στρες ή φλεγμονή. Το παρόν εύρημα είναι συναφές με τα προηγούμενα αποτελέσματα σχετικά με την φύλο-εξαρτώμενη έκφραση της πρωτεΐνης SMC1A που ανήκει στο σύμπλεγμα κοχεσίνης και το οποίο είναι γνωστό πως διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης. Συνολικά, η ανάλυση ανέδειξε ένα σημαντικό αριθμό φύλο-εξαρτώμενων συμβάντων εναλλακτικού ματίσματος στους ασθενείς και στους υγιείς, η λεπτομερής μελέτη των οποίων θα μπορούσε να οδηγήσει στην βαθύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τον φυλετικό διμορφισμό της αυτοανοσίας. Τέλος, διερευνήσαμε την εμφάνιση Προϊούσας Πολυεστιακής Λευκοεγκεφαλοπάθειας (PML) σε νεαρή γυναίκα ασθενή με ΣΕΛ με ήπια θεραπεία παρουσιάζοντας τις διαγνωστικές και θεραπευτικές προκλήσεις που σχετίζονται με την συγκεκριμένη επιπλοκή. Η PML αποτελεί μια σοβαρή, απομυελινωτική νόσο του κεντρικού νευρικού συστήματος, η οποία προκαλείται από τον ευρύτατα διαδεδομένο ιό πολυώμα John Cunningham (JCV) σε ασθενείς με μειωμένη ανοσιακή απόκριση. Προσπαθώντας να διαλευκάνουμε τους παράγοντες κινδύνου που συνδέονται με την PML στους ασθενείς με ΣΕΛ, πραγματοποιήσαμε ανάλυση του ανοσοφαινότυπου στο ολικό αίμα της ασθενούς καθώς και μελέτη γονιδιακών μεταλλάξεων με whole-exome sequencing. Οι αναλύσεις έδειξαν σημαντική Β-λεμφοπενία καθώς και επιβλαβείς γονιδιακές μεταλλάξεις στα γονίδια GATA2 και CDH7, υποδεικνύοντας ότι ενδογενείς παράγοντες της ασθενούς και όχι η ανοσοκατασταλτική θεραπεία, μπορεί να ευθύνονται για την επανενεργοποίηση του ιού και την εμφάνιση PML σε μια ομάδα ασθενών με ΣΕΛ.