Διαφοροποίηση γεωγραφικής προέλευσης δειγμάτων καλλιεργούμενης ρίγανης (Origanum vulgare subsp. hirtum) με ενόργανη ανάλυση, ανάλυση DNA και χημειομετρία

Abstract

This present study attempted to characterize and differentiate samples of cultivated oregano according to the geographical area of origin using instrumental analysis, DNA analysis, and chemometrics. For this purpose, a total of 142 samples of commercially available Greek oregano plants (Origanum vulgare subsp. hirtum), harvested from organic farms during the calendar years 2017-2018, were obtained. The samples came from five different geographical regions of Greece (Epirus, Macedonia, Crete, Peloponnese, and Thessaly) and specifically included: 5 oregano cultivars from the prefecture of Ioannina, 2 from the prefecture of Preveza, 2 from the prefecture of Kozani, 1 from the prefecture of Trikala, 2 from the prefecture of Magnesia, one from the prefecture of Pieria, one from the prefecture of Kilkis, 2 from the prefecture of Thessaloniki, one from the prefecture of Achaia, one from the prefecture of Ileia, one from the prefecture of Rethymno and one from the prefecture of Heraklion. The oregano samples were initially subjected to hydrodistillation (HD) and the resulting essential oils were determined for their total phenolic content (TPC) with the Folin-Ciocalteu method, their antioxidant activity (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) - TEAC) with the DPPH method, and their chemical composition. In addition, a quantitative determination of the four main compounds of the essential oils of the oregano samples (carvacrol, thymol, γ-terpinene, and p-cymene) was performed, as well as a semi-quantitative determination of all the remaining volatile components with the use of the combined technique of Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS). The essential oil yield levels of the oregano samples ranged from ~4% to 7%, with the highest yield recorded in the oregano samples from the region of Ileia and the lowest in the oregano samples from the region of Thessaloniki. The chromatographic analysis led to the identification of a total of 35 compounds, while 15 of them were found to be present in all samples. The components of the essential oils mostly consisted of oxygenated monoterpenes (65.67 − 83.98%) and monoterpene hydrocarbons (10.80 − 30.43%), while lower percentages were followed by sesquiterpene hydrocarbons (2.44 − 3.97%), oxygenated sesquiterpenes (0.40 - 1.92%) and other compounds (0.10 - 1.29%). The most abundant essential oil component in all samples was found to be carvacrol, except only in the essential oil samples from the region of Ileia where it was thymol. The rates of carvacrol in the oregano essential oil samples ranged from 28.74% to 68.8%, with the highest rate recorded in the oregano samples from Thessaloniki and the lowest in the oregano samples from Ileia. The second most abundant component of the essential oil samples was found to be thymol, with rates ranging from 7.4% to 35.2%. The highest thymol rate was recorded in the samples from Ileia and the lowest in the essential oil samples from Heraklion. The total rates of the four main components of oregano essential oils (carvacrol, thymol, γ-terpinene, and p-cymene) ranged from 85.1% to 89.54%, with the highest value recorded in the samples from the Rethymno area and the lowest in the samples from the area of Kozani.In addition, the total concentrations of the four main compounds of the cultivated oregano samples, as calculated during the quantitative determination, ranged from 6230 mg/L to 16540 mg/L, with the descending ranking order being as follows: Ileia > Heraklion > Preveza > Kilkis > Ioannina > Pieria > Kozani > Magnesia > Trikala > Thessaloniki > Rethymno > Achaea (the regions represent the samples that originate from them). The compound with the highest concentration was found to be carvacrol (10700 ± 1500 mg/L, Heraklion), while the highest values of the concentrations of the remaining three compounds were recorded in the essential oil sample from the area of Ileia: 8170 ± 260 mg/L for thymol, 860 ± 180 mg/L for γ-terpinene and 920 ± 53 mg/L for p-cymene.Of the compounds studied by semiquantitative determination, the compound with the highest concentration was found to be α-terpinene (112±14 mg/L, Ileia), followed by caryophyllene (101±10 mg /L, Pieria) and β-myrcene (91±14 mg/L, Ilia). The total sum of the concentrations of the semi-quantitatively determined compounds ranged from 406.23 mg/L to 721.02 mg/L, with the ranking order of the samples, in descending order, being as follows: Kilkis > Achaea > Ileia > Kozani > Ioannina > Magnesia > Trikala > Preveza > Pieria > Heraklion > Thes/ki > Rethymno.The TPC values of the essential oils of all oregano samples ranged from 74.5 ± 3.6 mg GAE/g EO to 89.0 ± 4.8 mg GAE/g EO, with the highest value recorded in the Achaea samples and the lowest in the samples from the area of Heraklion. Accordingly, the TEAC values ranged between 306.8 ± 5.0 μmol TE/g EO and 461.3 ± 7.3 μmol TE/g EO, with the samples from the region of Achaea yielding the lowest value, while the samples from the area of Rethymno the highest. The data obtained from the chemical analyses were then combined with the chemometric methods of analysis of variance (ANOVA), multivariate analysis of variance (MANOVA), and linear discriminant analysis (LDA) to investigate the possibility of classifying the oregano samples in terms of geographical origin. To facilitate this classification, the samples were divided into two groups (Group A – Ileia, Heraklion, Trikala, Thessaloniki, Kilkis and Preveza and Group B – Achaea, Rethymno, Magnesia, Pieria, Kozani and Ioannina). Although initially all parameters of the chemical analyses were incorporated into the statistical analysis, only those whose combination produced classification rates greater than 50% were ultimately chosen to be used. Specifically, the percentage ratios of the essential oil components and the TPC and TEAC values were the ones that were selected as dependent variables. Furthermore, Stepwise LDA (SLDA) was used as the final classification method, executing a stepwise selection process of variables, to distinguish and identify the ones with the highest discriminative power (markers) and, subsequently, optimize further the discrimination of the samples. The statistical treatment of the results of both groups showed that, while using the cross-validation method, most of the observations were correctly classified. Specifically, the combination of the percentage ratios of the essential oil components and the TPC and TEAC values of Group A produced a classification rate of 93.3%, while those of Group B yielded 82.7% respectively. Finally, from the total 33 parameters of Group A that were examined, the SLDA analysis showed 16 variables as markers, while from the 32 of Group B that were examined, the SLDA analysis showed 14 variables as markers. The use of the combinations of these variables in the statistical analysis was found to improve the classification rates in both cases: for Group A, from 93.3% to 100% and for Group B from 82.7% to 87, 8%.Twenty representative oregano samples were selected for the DNA analysis (one from each oregano cultivation), and their genomic DNA (nrDNA) was subsequently isolated. Initially, the PCR method was applied in order to amplify the ITS (Internal Transcribed Spacer) region of the nuclear ribosomal DNA, with the use of the isolated genomic DNA from the studied oregano samples as a template, and the universal primers ITS1 and ITS4. The PCR products were purified and sent to an appropriate laboratory for the determination of their nucleotide sequence. The generated sequences were compared with those in the database and then aligned using an appropriate program. Following the alignment of sequences, the phylogenetic trees were constructed by using two methods, Neighbor-Joining and UPGMA, while the reliability and stability of the dendrogram relationships were assessed through 1000 bootstrap samples. The phylogenetic analysis led to the complete separation of the samples in both methods, even when originating from the same region. To further determine the genetic diversity among the oregano samples, 15 RAPD molecular markers were utilized for detecting DNA polymorphism. Of the 15 primers tested, 13 gave a clear number of bands. The total number of amplified DNA bands given by the random primers was 107, of which 66 were polymorphic. The total polymorphism rate therefore amounted to 62%. After Jaccard similarity coefficients were calculated for all samples, a similarity matrix was constructed from which genetic distances were calculated. These distances were analyzed using a suitable program and again with the use of both UPGMA and NJ methods. As above, the phylogenetic analysis led to the complete separation of the samples using both methods.

Στην παρούσα έρευνα έγινε προσπάθεια χαρακτηρισμού και διαφοροποίησης φυτών καλλιεργούμενης ρίγανης σύμφωνα με τη γεωγραφική περιοχή προέλευσης, χρησιμοποιώντας ενόργανη ανάλυση, ανάλυση DNA και χημειομετρία. Για το σκοπό αυτό, ελήφθησαν συνολικά 142 δείγματα εμπορικά διαθέσιμων φυτών ρίγανης (Origanum vulgare subsp. hirtum) που συγκομίστηκαν κατά τα ημερολογιακά έτη 2017-2018 από βιολογικές καλλιέργειες. Τα δείγματα προήλθαν από πέντε διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές της Ελλάδας (Ήπειρος, Μακεδονία, Κρήτη, Πελοπόννησος και Θεσσαλία) και συγκεκριμένα αφορούσαν: πέντε καλλιέργειες από το νομό Ιωαννίνων, δύο από το νομό Πρεβέζης, δύο από το νομό Κοζάνης, μια από το νομό Τρικάλων, δύο από το νομό Μαγνησίας, μια από το νομό Πιερίας, μια από το νομό Κιλκίς, δύο από το νομό Θεσσαλονίκης, μια από το νομό Αχαΐας, μια από το νομό Ηλείας, μια από το νομό Ρεθύμνου και μια από το νομό Ηρακλείου. Τα φυτά ρίγανης υποβλήθηκαν αρχικά σε υδροαπόσταξη (hydrodistillation - HD) και στα προκύπτοντα αιθέρια έλαια έγινε προσδιορισμός της περιεκτικότητάς τους σε ολικό φαινολικό περιεχόμενο (Total Phenolic Content - TPC) με τη μέθοδο Folin-Ciocalteu, της αντιοξειδωτικής τους δράσης (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity - TEAC) με τη μέθοδο DPPH, της εκατοστιαίας τους σύστασης, καθώς και ποσοτικός προσδιορισμός των τεσσάρων βασικών συστατικών τους (καρβακρόλη, θυμόλη, γ-τερπινένιο και π-κυμένιο) και ημιποσοτικός προσδιορισμός όλων των υπολοίπων συστατικών με τη συνδυασμένη τεχνική της Αέριας Χρωματογραφίας- Φασματομετρίας Μάζας (GC-MS). Τα επίπεδα απόδοσης σε αιθέριο έλαιο των φυτών ρίγανης κυμάνθηκαν στο σύνολό τους από ~ 4% μέχρι 7%, με τη μεγαλύτερη απόδοση να καταγράφεται στα δείγματα ρίγανης από την περιοχή της Ηλείας και τη μικρότερη στα δείγματα ρίγανης από την περιοχή της Θεσσαλονίκης. Η χρωματογραφική ανάλυση οδήγησε στην ταυτοποίηση 35 συνολικά ενώσεων στα αιθέρια έλαια των δειγμάτων, ενώ 15 από αυτές βρέθηκαν παρούσες σε όλα τα δείγματα. Τα συστατικά των αιθέριων ελαίων στο μεγαλύτερο τους μέρος αποτελούνταν από οξυγονωμένα μονοτερπένια (65,67 − 83,98%) και μονοτερπενικούς υδρογονάνθρακες (10,80 − 30,43%), ενώ σε χαμηλότερα ποσοστά ακολούθησαν οι σεσκιτερπενικοί υδρογονάνθρακες (2,44 − 3,97%) , τα οξυγονωμένα σεσκιτερπένια (0,40 − 1,92%) και οι λοιπές ενώσεις (0,10 − 1,29%). Το κυρίαρχο συστατικό στα αιθέρια έλαια όλων των δειγμάτων βρέθηκε να είναι η καρβακρόλη, με εξαίρεση μόνο τα δείγματα αιθέριου ελαίου από την περιοχή της Ηλείας όπου βρέθηκε η θυμόλη. Τα ποσοστά της καρβακρόλης κυμάνθηκαν από 28,74% έως 68,8%, με το υψηλότερο ποσοστό να καταγράφεται στα δείγματα αιθέριου ελαίου από την περιοχή της Θεσσαλονίκης και το μικρότερο στα δείγματα από την περιοχή της Ηλείας. Το δεύτερο σε εκατοστιαία αναλογία συστατικό βρέθηκε να είναι η θυμόλη, με ποσοστά από 7,4% έως 35,2%, με το υψηλότερο ποσοστό αυτής να καταγράφεται στα δείγματα από την Ηλεία και το μικρότερο στα δείγματα αιθέριου ελαίου από το Ηράκλειο. Το σύνολο των ποσοστών των τεσσάρων βασικών συστατικών των αιθέριων ελαίων ρίγανης (καρβακρόλη, θυμόλη, γ-τερπινένιο και π-κυμένιο) κυμάνθηκε από 85,10% έως 89,54%, με την υψηλότερη τιμή να καταγράφεται στα δείγματα από την περιοχή του Ρεθύμνου και τη χαμηλότερη στα δείγματα από την περιοχή της Κοζάνης.Επιπλέον, οι συνολικές συγκεντρώσεις των τεσσάρων βασικών ενώσεων των αιθέριων ελαίων των δειγμάτων καλλιεργούμενης ρίγανης, όπως υπολογίστηκαν κατά τον ποσοτικό προσδιορισμό τους, κυμάνθηκαν από 6230 mg/L έως 16540 mg/L, με τη σειρά κατάταξης των δειγμάτων σε φθίνουσα σειρά να διαμορφώνεται ως εξής Ηλεία > Ηράκλειο > Πρέβεζα > Κιλκίς > Ιωάννινα > Πιερία > Κοζάνη > Μαγνησία > Τρίκαλα > Θεσσαλονίκη > Ρέθυμνο > Αχαΐα (οι περιοχές αντιπροσωπεύουν τα δείγματα που προέρχονται από αυτές). Η ένωση με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση βρέθηκε να είναι η καρβακρόλη (10700 ± 1500 mg/L, Ηράκλειο), ενώ οι υψηλότερες τιμές των συγκεντρώσεων των υπολοίπων τριών ενώσεων καταγράφηκαν στα δείγματα αιθέριου ελαίου από την περιοχή της Ηλείας και ήταν 8170 ± 260 mg/L για τη θυμόλη, 860 ± 180 mg/L για το γ-τερπινένιο και 920 ± 53 mg/L για το π-κυμένιο. Από τις ενώσεις που μελετήθηκαν με ημιποσοτικό προσδιορισμό, η ένωση με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση βρέθηκε να είναι το α-τερπινένιο (112±14 mg/L, Ηλεία), ακολουθούμενη από το καρυοφυλλένιο (101±10 mg/L, Πιερία) και το β-μυρκένιο (91±14 mg/L, Ηλεία). Το συνολικό άθροισμα των συγκεντρώσεων των ενώσεων που προσδιορίστηκαν ημιποσοτικά κινήθηκε από 406,23 mg/L έως 721,02 mg/L, με τη σειρά κατάταξης των δειγμάτων σε φθίνουσα σειρά να διαμορφώνεται ως εξής: Κιλκίς > Αχαΐα > Ηλεία > Κοζάνη > Ιωάννινα > Μαγνησία > Τρίκαλα > Πρέβεζα > Πιερία > Ηράκλειο > Θεσσαλονίκη > Ρέθυμνο. Οι τιμές TPC των αιθέριων ελαίων όλων των δειγμάτων ρίγανης κυμάνθηκαν από 74,5 ± 3,6 mg GAE/g EO έως 89,0 ± 4,8 mg GAE/g EO, με την υψηλότερη τιμή να καταγράφεται στα δείγματα της Αχαΐας και τη μικρότερη στα δείγματα από την περιοχή του Ηρακλείου. Αντίστοιχα, οι τιμές TEAC κυμάνθηκαν μεταξύ 306,8 ± 5,0 μmol TE/g EO και 461,3 ± 7,3 μmol TE/g EO, με τα δείγματα από την περιοχή της Αχαΐας να καταγράφουν τη μικρότερη τιμή, ενώ τα δείγματα από την περιοχή του Ρεθύμνου την υψηλότερη.Τα δεδομένα που αποκτήθηκαν από τις χημικές αναλύσεις συνδυάστηκαν με τις χημειομετρικές μεθόδους ανάλυσης διακύμανσης (ANOVA), πολυμεταβλητής ανάλυσης διακύμανσης (MANOVA) και γραμμικής διακριτικής ανάλυσης (LDA) για τη διερεύνηση της δυνατότητας ταξινόμησης των δειγμάτων ρίγανης ως προς τη γεωγραφική προέλευση. Για τη διευκόλυνση της ταξινόμησης, τα δείγματα χωρίστηκαν σε δυο ομάδες (Ομάδα Α – Ηλεία, Ηράκλειο, Τρίκαλα, Θεσσαλονίκη, Κιλκίς και Πρέβεζα και Ομάδα Β – Αχαΐα, Ρέθυμνο, Μαγνησία, Πιερία, Κοζάνη και Ιωάννινα). Παρόλο που ενσωματώθηκαν αρχικά όλοι οι παράμετροι των χημικών αναλύσεων στην στατιστική ανάλυση, επιλέχθηκαν τελικά να χρησιμοποιηθούν μόνο εκείνες των οποίων ο συνδυασμός έδωσε ποσοστά διαχωρισμού άνω του 50%. Συγκεκριμένα, επιλέχθηκαν ως εξαρτημένες μεταβλητές οι επί τοις εκατό αναλογίες των συστατικών των αιθέριων ελαίων και οι τιμές TPC και TEAC. Τέλος, ως ύστατη μέθοδος ταξινόμησης χρησιμοποιήθηκε η σταδιακή εφαρμογή LDA (Stepwise LDA, SLDA) μέσω μιας διαδικασίας κλιμακωτής επιλογής μεταβλητών για τη διάκριση και τον εντοπισμό αυτών που διαθέτουν την υψηλότερη διακριτική δύναμη (markers) προκειμένου να βελτιστοποιηθεί περαιτέρω ο διαχωρισμός των δειγμάτων. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων και των δύο ομάδων έδειξε ότι το μεγαλύτερο μέρος του συνόλου των παρατηρήσεων κατατάχθηκε σωστά με τη μέθοδο της ενδοεπικύρωσης. Συγκεκριμένα, οι επί τοις εκατό αναλογίες των συστατικών των αιθέριων ελαίων σε συνδυασμό με τις τιμές TPC και TEAC της Ομάδας Α έδωσαν ποσοστό διαχωρισμού 93,3%, ενώ της Ομάδας Β έδωσαν 82,7% αντίστοιχα. Τέλος, από τις συνολικές 33 παραμέτρους της Ομάδας Α που εξετάστηκαν, η ανάλυση SLDA κατέδειξε 16 μεταβλητές ως markers, ενώ από τις 32 της Ομάδας Β που εξετάστηκαν, η ανάλυση SLDA κατέδειξε 14 μεταβλητές ως markers. Η χρήση των συνδυασμών των μεταβλητών αυτών στην στατιστική ανάλυση βρέθηκε ότι βελτίωσε τα ποσοστά διαχωρισμού και στις δυο περιπτώσεις: για την Ομάδα Α, από ποσοστό 93,3% ανέβηκε στο 100% και για την Ομάδα Β από 82,7% ανέβηκε στο 87,8%. Κατά την ανάλυση DNA, επιλέχθηκαν 20 αντιπροσωπευτικά δείγματα ρίγανης (ένα από κάθε καλλιέργεια) από τα οποία και απομονώθηκε γενωμικό DNA (nrDNA). Στη συνέχεια εφαρμόσθηκε αρχικά η τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase chain reaction -PCR) για την ενίσχυση της ενδομεταγραφόμενης (Internal Transcribed Spacer -ITS) περιοχής του πυρηνικού ριβοσωμικού DNA χρησιμοποιώντας ως μήτρα το απομονωμένο γενωμικό DNA από τα υπό μελέτη δείγματα ρίγανης και τους καθολικούς εκκινητές ITS1 και ITS4. Τα προϊόντα των αντιδράσεων PCR, αφού καθαρίστηκαν, στάλθηκαν προς προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής τους αλληλουχίας σε κατάλληλο εργαστήριο. Οι παραγόμενες αλληλουχίες συγκρίθηκαν με αλληλουχίες της βάσης δεδομένων και στη συνέχεια ευθυγραμμίστηκαν με τη βοήθεια κατάλληλου προγράμματος. Μετά την ευθυγράμμιση των αλληλουχιών, κατασκευάστηκαν τα φυλογενετικά δέντρα με δύο μεθόδους, τις NJ (Neighbor-Joining) και UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean), ενώ η αξιοπιστία και η σταθερότητα των σχέσεων του δενδρογράμματος εκτιμήθηκε μέσω 1000 επαναλήψεων (bootstraps). Η φυλογενετική ανάλυση οδήγησε σε πλήρη διαχωρισμό των δειγμάτων και με τις δύο μεθόδους, ακόμα και σε αυτά που προήλθαν από την ίδια περιοχή.Για τον περαιτέρω προσδιορισμό της γενετικής ποικιλότητας μεταξύ των δειγμάτων ρίγανης δοκιμάστηκαν 15 μοριακοί δείκτες RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA- Τυχαία Ενισχυμένα Πολυμορφικά Τμήματα DNA) για την ανίχνευση του πολυμορφισμού του DNA. Από τους 15 εκκινητές που δοκιμάσθηκαν, ευκρινή αριθμό ζωνών έδωσαν οι 13. Ο συνολικός αριθμός των ενισχυμένων ζωνών DNA που έδωσαν οι τυχαίοι εκκινητές ήταν 107, από τις οποίες πολυμορφικές ήταν οι 66. Το συνολικό ποσοστό πολυμορφισμού, επομένως, ανήλθε στο 62%. Αφού υπολογίστηκαν οι συντελεστές ομοιότητας του Jaccard για όλα τα δείγματα, κατασκευάστηκε μια μήτρα ομοιότητας με βάση την οποία υπολογίστηκαν οι γενετικές αποστάσεις. Οι αποστάσεις αυτές αναλύθηκαν και πάλι με τη χρήση κατάλληλου προγράμματος και τις μεθόδους UPGMA και NJ. Όπως και παραπάνω, προέκυψαν δύο φυλογενετικά δενδρογράμματα, στα οποία, σε συμφωνία με τη φυλογενετική ανάλυση με βάση τις αλληλουχίες της περιοχής ITS, παρατηρήθηκε πλήρης διαχωρισμός των δειγμάτων και με τις δύο μεθόδους.