Νανοδομημένη επιφάνεια πυριτίου για οπτικούς αισθητήρες

Abstract

Raman spectroscopy and fluorescence imaging are considered reliable methods for evaluating the molecular structure of substances, with a wide range of applications. In recent years, there has been a strong research interest in establishing non-invasive analytical techniques for detecting substances of biological interest in a variety of biomedical applications based on these two methods. However, due to the weak signals provided by these two techniques and the particularly low concentrations limits for these substances in the samples, these methods are very difficult to fulfill the requirements of modern research. The observation of signal enhancement with the use of metal nanoparticles and especially noble metals, such as silver and gold, has spurred further development of spectroscopic methods. The discovery of Surface Enhanced Raman Spectroscopy-SERS as well as Surface Enhanced Fluorescence-SEF, satisfied the need for high signals and allowed detection of very low analyte concentrations, even down to a single molecule (single molecule detection). Concurrently with the discovery of these phenomena, a significant and systematic effort has begun in order to fabricate suitable substrates through a multitude of methods and structures to maximize signal amplifications and achieve the detection of very low concentrations with high repeatability. The primary goal of this doctoral thesis is the development of sensitive optical biosensors for the immunochemical determination of cancer markers and the direct and indirect determination of oxidative stress markers. The determination of these markers is based on the SERS spectroscopy as well as the fluorescence enhancement through the interaction with the plasmons excited in me-tallic nanostructures adjacent to the substances under investigation. The key core in this investigation is the fabrication and development of suitable nanostructured silicon/silver active substrates that can provide the plasmonic enhancement increasing the detection sensitivity compared to other detection techniques. The substrate growth method is based on Metal-Assisted Chemical Etching (MACE) technique. Specifically, these substrates consist of silicon nanowires, where silver nanoparticles are grown on their surface in the form of aggregates or dendrites. These active substrates were evaluated initially for standard substances such as rhodamine, crystal violet and finally for the detection of cancer markers and in particular three markers related to gynecological cancers, and especially of ovarian cancer: Cancer antigen 125 (CA-125), Human epididymis secretory protein 4 (HE4), and Survivin or BIRC5. In addition, the same substrates were evaluated for the detection of markers of oxidative stress, specifically the substances glutathione (GSH), malondialdehyde (MDA), catalase (CAT), uric acid (UA), Manganese superoxide dismutase (MnSOD) as well as the protein carbonyls. From the study with the standard substance rhodamine (R6G), it was observed that both types of active substrates developed showed high detection sensitivity, however, silver aggregates exhibited lower detection limit and significantly better homogeneity than silver dendrites. Therefore, these specific substrates were selected as the most suitable for the detection of biomolecules through SERS experiments. Oxidative stress markers were detected in buffer solutions and artificial saliva. Specifically, for GSH and MDA, measurements were also carried out in natural saliva. Similarly, the detection of cancer markers detection was performed in standard solution prepared in buffer. From the results of the Raman measurements, it emerged that the surfaces with the silver aggregates present high detection sensitivity (Limit of Detection-LOD) and their dynamic range covers the concentration ranges determined in both healthy individuals and patients. A similar study with the standard substance R6G was carried out on both types of substrates for detection through Photoluminescence (PL). The study revealed that the substrates with the silver dendrites are more suitable for PL experiments for the detection of the above biomolecules compared to those with silver aggregates. Measurements of the cancer markers and the oxidative stress markers GSH, MDA, MnSOD and protein carbonyls, showed that the substrates with the silver dendrites offer a satisfactory sensitivity and dynamic range that covers the concentrations determined in healthy individuals as well as in patients. Thus, the substrates developed in this thesis are suitable for the development of sensitive optical sensors for the determination of biomarkers through Raman or PL measurements.

Τόσο η φασματοσκοπία Raman όσο και η απεικόνιση μέσω φθορισμού θεωρούνται αξιόπιστες μέθοδοι για την αξιολόγηση της μοριακής δομής ουσιών, με ένα πολύ ευρύ φάσμα εφαρμογών. Τα τελευταία χρόνια, υπάρχει έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον ώστε αυτές οι δύο μέθοδοι να αναδειχτούν ως δυο μη επεμβατικές μέθοδοι για την ανίχνευση ουσιών βιολογικού ενδιαφέροντος σε μια πληθώρα βιοϊατρικών εφαρμογών. Ωστόσο, λόγω των ασθενών σημάτων που δίνουν αυτές οι δύο τεχνικές ανίχνευσης και των ιδιαίτερα χαμηλών συγκεντρώσεων των ουσιών, οι συμβατικές μέθοδοι είναι πολύ δύσκολο να εκπληρώσουν τις απαιτήσεις της σύγχρονης έρευνας. Η παρατήρηση της ενίσχυσης του σήματος με τη χρήση μεταλλικών νανοσωματιδίων και ιδιαίτερα ευγενών μετάλλων, με κύριους εκπροσώπους τον άργυρο και τον χρυσό αποτέλεσε το έναυσμα για την περαιτέρω ανάπτυξη των φασματοσκοπικών μεθόδων. Η ανακάλυψη της επιφανειακής ενίσχυσης σκέδασης Raman (Surface Enhanced Raman Spectroscopy-SERS) και της επιφανειακής ενίσχυσης φθορισμού (Sur-face Enhanced Fluorescence-SEF), εξυπηρέτησε την ανάγκη για υψηλά σήματα και ανίχνευση πολύ χαμηλών συγκεντρώσεων ακόμα και ενός μόνο μορίου (single molecule detection). Παράλληλα με την ανακάλυψη των παραπάνω φαινομένων, ξεκίνησε μια σημαντική και συστηματική προσπάθεια για την κατασκευή κατάλληλων υποστρωμάτων με πληθώρα μεθόδων και δομών, ώστε να παρέχεται η δυνατότητα για πολύ μεγάλες ενισχύσεις του σήματος, σε συνδυασμό με την ανίχνευση πολύ χαμηλών συγκεντρώσεων με μεγάλη επαναληψιμότητα.Κύριος στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η ανάπτυξη ευαίσθητων οπτικών βιοαισθητήρων για τον ανοσοχημικό προσδιορισμό καρκινικών δεικτών και τον άμεσο ή έμμεσο προσδιορισμό δεικτών οξειδωτικού στρες. Ο προσδιορισμός των παραπάνω δεικτών, στηρίζεται στην ενισχυμένη φασματοσκοπία SERS καθώς και στην ενίσχυση του φθορισμού μέσω της αλληλεπίδρασης με τα πλασμόνια που διεγείρονται σε μεταλλικές νανοδομές που γειτνιάζουν με τις υπό διερεύνηση ουσίες. Ο βασικός πυρήνας στη διερεύνηση αυτή είναι η κατασκευή και ανάπτυξη κατάλληλων ενεργών υποστρωμάτων νανοδομημένου πυριτίου/ αργύρου τα οποία δύναται να παρέχουν την πλασμονική ενίσχυση αυξάνοντας σημαντικά την ευαισθησία της ανίχνευσης σε σχέση με άλλες τεχνικές ανίχνευσης. Η μέθοδος ανάπτυξης των υποστρωμάτων βασίζεται στη χημική εγχάραξη πυριτίου υποβοηθούμενη από μέταλλο (Metal-Assisted Chemical Etching-MACE). Συγκεκριμένα τα υποστρώματα αυτά αποτελούνται από νανονήματα πυριτίου, όπου στην επιφάνειά τους έχουν αναπτυχθεί νανοσωματίδια αργύρου με τη μορφή συσσωματωμάτων ή δενδριτών. Τα ενεργά υποστρώματα αξιολογήθηκαν κατ’ αρχήν μέσω της ανίχνευσης πρότυπων ουσιών όπως η ροδαμίνη, crystal violet και τελικά για την ανίχνευση καρκινικών δεικτών και συγκεκριμένα τριών δεικτών που σχετίζονται με γυναικολογικούς καρκίνους και κυρίως τον καρκίνο των ωοθηκών, το καρκινικό αντιγόνο 125 (CA-125), η ανθρώπινη εκκριτική πρωτεΐνη 4 (HE4) της επιδιδυμίδας, και τη σουρβιβίνη ή BIRC5. Επιπλέον, τα ίδια υποστρώματα αξιολογήθηκαν για την ανίχνευση δεικτών οξειδωτικού στρες και συγκεκριμένα των ουσιών γλουταθειόνη (GSH) μαλονδιαλδεΰδη (MDA), καταλάση (CAT), ουρικό οξύ (UA), υπεροξειδική δισμουτάση (MnSOD) καθώς και για την ανίχνευση πρωτεϊνικών καρβονυλίων.Από τη μελέτη με την πρότυπη ουσία ροδαμίνη (R6G), παρατηρήθηκε ότι και τα δύο είδη ενεργών υποστρωμάτων που αναπτύχθηκαν παρουσιάζουν υψηλή ευαισθησία. Παρόλα αυτά τα συσσωματώματα αργύρου παρουσιάζουν χαμηλότερο όριο ανίχνευσης και αισθητά καλύτερη ομοιογένεια αποτελεσμάτων για ανίχνευση μέσω SERS παρά για ανίχνευση φωτοφωταύγειας. Συνεπώς, τα συγκεκριμένα υποστρώματα επιλέχθηκαν ως καταλληλότερα για την ανίχνευση βιομορίων μέσω πειραμάτων SERS. Πραγματοποιήθηκε ανίχνευση των παραπάνω δεικτών οξειδωτικού στρες σε ρυθμιστικά διαλύματα και τεχνητό σίελο. Ειδικά για την περίπτωση της GSH και MDA πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις και σε φυσικό σίελο. Αντίστοιχα για τους καρκινικούς δείκτες πραγματοποιήθηκε ανίχνευση σε ρυθμιστικό διάλυμα. Από τα αποτελέσματα των μετρήσεων Raman, προέκυψε ότι οι μέθοδοι που αναπτύχθηκαν στις οι επιφάνειες με τα συσσωματώματα αργύρου παρουσιάζουν υψηλή ευαισθησία ανίχνευσης (Limit of Detection-LOD) και δυναμική περιοχή, που καλύπτει το φάσμα συγκεντρώσεων τόσο υγειών ατόμων όσο και ασθενών. Αντίστοιχη μελέτη με την πρότυπη ουσία R6G πραγματοποιήθηκε στα δυο είδη υποστρωμάτων για ανίχνευση μέσω φωτοφωταύγειας (Photoluminescence). Από τη μελέτη, πρόκυψε ότι τα υποστρώματα με τους δενδρίτες αργύρου είναι καταλληλότερα για πειράματα PL σε σχέση με τα υποστρώματα με τα συσσωματώματα αργύρου. Από τις μετρήσεις που πραγματοποιήθηκαν στους καρκινικούς δείκτες και στους δείκτες οξειδωτικού στρες GSH, MDA, MnSOD και καρβοξύλια πρωτεϊνών, προέκυψε ότι για την περίπτωση των παραπάνω ουσιών τα υποστρώματα με τους δεν-δρίτες αργύρου προσφέρουν ικανοποιητική ευαισθησία και δυναμική που καλύπτει όλο το εύρος των συγκεντρώσεων για υγιείς και ασθενείς.Επομένως τα υποστρώματα που αναπτύχθηκαν στην παρούσα διδακτορική διατριβή είναι κατάλληλα για την ανάπτυξη ευαίσθητων οπτικών βιοαισθητήρων για τον προσδιορισμό βιοδεικτών μέσω μετρήσεων Raman ή φωτοφωταύγειας.