Ηπατοκυτταρικός καρκίνος σε υπόβαθρο ιικής λοίμωξης και ο ρόλος επιλεγμένων βιοδεικτών

Abstract

Liver cancer is one of the most lethal cancers and HCV infection is currently one of the leading causes of chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). There are 1.5 million new cases of hepatitis C each year, and estimates for 2022 indicate that there were about 58 million virus carriers globally. Furthermore, in 2019 alone, there were 290,000 patient fatalities from hepatitis C, primarily due to cirrhosis and HCC. Direct-acting antivirals successfully treat over 95% of patients; however, the risk of developing HCC is elevated, particularly when fibrosis is present. This is primarily because of epigenetic modifications that result in post-translational modifications of proteins and consequently chronic diseases such as fibrosis, inflammation, and steatosis. The necessity to clarify the currently understood epigenetic pathways induced by HCV leading to chronic diseases is underscored, given the slow progression of liver disease and the absence of symptoms for many years after the initial event of infection. The cellular factors that dictate the course of HCV infection are still unresolved mostly because they are rarely looked at on the onset of infection since they do not exhibit symptoms. In addition, the heterogeneity of the numerous viral strains makes it challenging to draw firm conclusions. HCV, in order to use the host cell as a factory for replication, recruits its proteins to change cellular function and produce an environment that is favorable to its reproduction. Lysine-specific demethylases 1 and 2 (LSD1 and LSD2), which function by demethylating methylated lysine residues, are a class of epigenetic factors that regulate numerous cellular activities and may mediate changes in cellular function for HCV replication. Beyond histones, LSDs also target non-histone proteins like p53 to modify their post-translational activity. LSD1 enzymatic activity and normal expression abnormalities have been linked to a number of cancers, including HCC. Lately, the role of LSD1 in the successful establishment of infections by several viruses was examined, including hepatitis B and herpes simplex virus type 1, as well as in the suppression of others, such influenza type A or vesicular stomatitis virus.LSD2, the homolog protein of LSD1, has been studied to a much lesser extent than the first. There are data supporting that it participates in the lipid metabolism of hepatocytes and in the control of the transcriptional machinery as well as in carcinogenic pathways. To date, LSD2 has not been associated with viral infections. Taking into account all the above, the first aim of this study was to investigate the endogenous levels of LSDs during HCV infection and any potential effects on fundamental cellular processes that can result in adverse changes in cellular phenotype. At the same time, we intended to examine the potential involvement of LSDs in the progression of HCV infection as well as the mechanisms involved. It is well established that HCV increases matrix metalloproteinases (MMPs), proteases that degrade extracellular matrix components. The activity of these proteins is regulated by cytokines and pro-inflammatory regulators and by the extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN), a transmembrane glycoprotein which participates in the extracellular matrix remodeling, cell differentiation and energy metabolism. EMMPRIN overexpression and hyperglycosylation have been shown to be closely associated with HCC metastasis. It has been observed that intrahepatic metastases occur frequently during HCC, significantly worsening the prognosis for patients. Furthermore, current studies demonstrate that the pre-metastatic events begin considerably earlier than the time a metastasis is found. Viruses like HCV accelerate cell motility. Thus, testing a putative LSD1-EMMPRIN-MMPs axis and its role in the development of HCV-induced metastatic cancer was also of great concern of this study. In our experiments, we used Huh7.5 cell line, as well as viral stocks of HCV-2a and -3a strains which differ significantly in terms of their function, rate of replication, and impact on cellular phenotype. Infections were conducted under the modulation of LSD1 or LSD2 endogenous expression by genetic engineering methods, in order to ivestigate their role in HCV infection. It was found that the overexpression of LSD1 inhibits viral replication while its elimination greatly increases it, indicating that LSD1 has a detrimental function in the development of a successful viral infection. The aforementioned findings were also verified in triple co-cultures of hepatocytes with hepatic sinusoidal cells, which was used to simulate the in vivo microenvironment. On the other hand, bypassing the entry of viruses upon LSD1 overexpression by direct transfection with HCV RNA, showed no inhibition of viral replication. This led us to the conclusion that, in the presence of LSD1 overexpression, viral replication can only occur if the HCV virus entry stage is omitted. The kinetics of infection did not seem to be significantly affected by LSD2 overexpression. Interferon-induced transmembrane protein 3 (IFITM3), which is located on the membrane of endosomes and lysosomes, participates in the host defense against viruses that follow the endocytosis pathway by directing incoming viruses into lysosomes. Interestingly, its antiviral properties are triggered by LSD1 demethylating the monomethylated K88 residue. It was observed that IFITM3 expression was increased by HCV-infection, independent of LSD1 levels, emphasizing its function as an HCV defensive mechanism. In fact, in LSD1 overexpression, IFITM3 levels remained elevated even 24 hours after infection. Furthermore, in overexpression conditions, inactive IFITM3 was reduced after infection, while in LSD1 overexpression it was diminished, indicating increased antiviral activity of IFITM3.It is well established that the presence of intracellular lipids is essential to the life cycle of HCV and that modifying lipid metabolism is necessary to produce an intracellular milieu rich in lipids, which in turn facilitates HCV replication, assembly and secretion from the cell. The activation of de novo fatty acid biosynthesis and the production of lipid droplets (LDs), which are essential for viral replication, are essential for a successful infection. Experiments using LD staining demonstrated a significant decrease in LD numbers upon LSD1 overexpression, even in HCV-infected cells, possibly impeding viral assembly. Regarding the later stages of infection, we showed that HCV causes a gradual hyperglycosylation of EMMPRIN within the cell, most likely as a result of long-term LSD1 oscillations induced by long-term HCV infection that promotes EMMPRIN hyperglycosylation. Concerning the induction of MMPs, the ratio of high/low glycosylated EMMPRIN is of importance. The current investigation indicated the existence of an LSD1-EMMPRIN-MMPs axis that may be enhanced by HCV infection, inducing pro-metastatic mechanisms. This thesis highlighted the function of LSD1 in HCV infection as well as the regulation of LSD2, which has not previously been investigated in viral infections. Furthermore, the detrimental role of LSD1 occurs at two distinct phases of the viral cycle. Ultimately, it was discovered that LSD1 is involved in pre-metastatic processes via EMMPRIN, triggered by HCV. These findings serve as a basis for a more thorough investigation of the mechanisms underlying the development of hepatocarcinogenesis and the link between HCV infection and chronic liver disease.

Η λοίμωξη από τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV) αποτελεί σήμερα μια από τις κυριότερες αιτίες χρόνιας ηπατίτιδας, κίρρωσης και ηπατοκυτταρικού καρκίνου (ΗΚΚ), ενώ ο καρκίνος του ήπατος αποτελεί έναν από τους πιο θανατηφόρους καρκίνους. Κάθε χρόνο σημειώνονται 1.5 εκατομμύρια νέα περιστατικά ηπατίτιδας C, ενώ όπως υπολογίστηκε για το 2022, απαριθμούνται περίπου 58 εκατομμύρια φορείς του ιού παγκοσμίως. Επιπλέον, μόνο το 2019 σημειώθηκαν 290.000 θάνατοι ασθενών με ηπατίτιδα C. Οι αιτίες θανάτου ήταν η κίρρωση και ο ΗΚΚ. Παρόλο που τα αντιιικά άμεσης δράσης θεραπεύουν αποτελεσματικά ποσοστό άνω του 95% των ασθενών, ο κίνδυνος ανάπτυξης ΗΚΚ παραμένει αυξημένος, ιδιαίτερα σε περιπτώσεις ασθενών με υπόβαθρο ίνωσης και κίρρωσης, κυρίως λόγω των επιγενετικών αλλαγών στο κύτταρο που προκαλούν με τη δράση τους οι ιικές πρωτεΐνες και οδηγούν σε χρόνια νόσο που περιλαμβάνει στεάτωση, φλεγμονή και ίνωση. Δεδομένης της αργής εξέλιξης της ηπατικής νόσου, καθώς και της απουσίας συμπτωμάτων για πολλά χρόνια μετά τη λοίμωξη, καθίσταται επιτακτική η ανάγκη αποσαφήνισης των, άγνωστων μέχρι σήμερα, επιγενετικών μηχανισμών που επάγονται από τον HCV και οδηγούν σε χρόνια νόσο, συμβάλλοντας έτσι στη στόχευση νέων μονοπατιών με σκοπό την έγκαιρη θεραπεία ή την πρόληψη. Τέλος, οι κυτταρικοί παράγοντες που καθορίζουν την εξέλιξη της HCV μόλυνσης παραμένουν άγνωστοι, κυρίως επειδή οι φορείς σπάνια ελέγχονται κατά την έναρξη της μόλυνσης, λόγω της απουσίας συμπτωμάτων, αλλά και λόγω της ετερογένειας των πολλών ιικών στελεχών που δυσχεραίνει την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων. Ο HCV, προκειμένου να χρησιμοποιήσει το κύτταρο-ξενιστή ως εργοστάσιο για την αναπαραγωγή του, στρατολογεί τις πρωτεΐνες του με σκοπό τη μεταβολή της κυτταρικής φυσιολογίας και τη δημιουργία ενός περιβάλλοντος ευνοϊκού για τον ιικό αναδιπλασιασμό. Μια ομάδα επιγενετικών παραγόντων που ρυθμίζει πολλές κυτταρικές λειτουργίες και θα μπορούσε να μεσολαβήσει στις αλλαγές της κυτταρικής λειτουργίας προς όφελος της αναπαραγωγής του HCV αποτελείται από τις ειδικές για τη λυσίνη απομεθυλάσες 1 και 2 (lysine-specific demethylase 1 και 2, LSD1 και LSD2), οι οποίες δρουν απομεθυλιώνοντας μεθυλιωμένα κατάλοιπα λυσίνης. Μέσω της απομεθυλίωσης των ιστονών ρυθμίζουν επιγενετικά την έκφραση γονιδίων, ενώ στοχεύουν και μη ιστονικές πρωτεΐνες, όπως για παράδειγμα την p53, μεταβάλλοντας μετα-μεταφραστικά τη δράση τους. Διαταραχές στη φυσιολογική έκφραση και την ενζυμική ενεργότητα της LSD1 έχουν συνδεθεί με διάφορους τύπους καρκίνου, μεταξύ αυτών και του ΗΚΚ. Τα τελευταία χρόνια διερευνήθηκε έντονα η συμμετοχή της LSD1 στην επιτυχή εγκαθίδρυση μολύνσεων από διάφορους ιούς, όπως ο ιός του απλού έρπητα τύπου 1, ο ιός της ηπατίτιδας Β αλλά και στην αναστολή άλλων, όπως ο ιός της φυσαλιδώδους στοματίτιδας ή ο ιός της γρίπης τύπου Α. H LSD2, ομόλογη πρωτεΐνη της LSD1, παρότι έχει μελετηθεί σε πολύ μικρότερο βαθμό, φαίνεται πως συμμετέχει στον λιπιδικό μεταβολισμό των ηπατοκυττάρων και στον έλεγχο της μεταγραφής, καθώς και σε μονοπάτια καρκινογένεσης. Μέχρι σήμερα δεν έχει συσχετιστεί με τις ιικές μολύνσεις.Με βάση όλα τα παραπάνω, πρώτος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η καταγραφή των ενδογενών επιπέδων των LSDs κατά την HCV μόλυνση και η συσχέτισή τους με βασικές κυτταρικές λειτουργίες που συμμετέχουν και που θα μπορούσαν να εξηγήσουν δυσμενείς διαταραχές του κυτταρικού φαινοτύπου. Παράλληλα, τέθηκε ως στόχος και η διερεύνηση του πιθανού ρόλου των δύο μορίων στην εξέλιξη της ίδιας της μόλυνσης, καθώς και οι μηχανισμοί που πιθανώς συμμετέχουν. Επιπρόσθετα, έχει αναφερθεί πως ο HCV αυξάνει την έκφραση και την ενεργοποίηση των μεταλλοπρωτεϊνασών στρώματος (matrix metalloproteinases, MMPs), δηλαδή των πρωτεασών που διασπούν με πρωτεόλυση τα μόρια της εξωκυττάριας ουσίας. Η δράση των πρωτεϊνών αυτών ρυθμίζεται από κυτταροκίνες και προφλεγμονώδεις παράγοντες, όπως και από τον επαγωγέα μεταλλοπρωτεϊνασών εξωκυττάριας ουσίας (extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN), μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη της οικογένειας των ανοσοσφαιρινών, με ρόλους στην επικοινωνία, στη διαφοροποίηση, στην αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας ουσίας και στο μεταβολισμό ενέργειας. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, η υπερέκφραση και η υπεργλυκοζυλίωση της EMMPRIN είναι άρρηκτα συνδεδεμένες με τη μετάσταση του ΗΚΚ. Σημειώνεται πως κατά τον ΗΚΚ συχνά παρουσιάζονται ενδοηπατικές μεταστάσεις που μειώνουν δραματικά την πρόγνωση των ασθενών. Επίσης, πολύ πρόσφατα δεδομένα υποδεικνύουν πως οι μηχανισμοί που επάγουν μετάσταση δρουν πολύ νωρίτερα από τη χρονική στιγμή που αυτή διαπιστώνεται. Ιοί όπως ο HCV έχουν τη δυνατότητα να διεγείρουν την κίνηση των κυττάρων. Έτσι, ο δεύτερος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση ενός πιθανού άξονα LSD1-EMMPRIN-MMPs και η συμβολή του στην εξέλιξη του HCV-επαγόμενου μεταστατικού καρκίνου. Κατά την πειραματική διαδικασία χρησιμοποιήθηκε η ηπατική κυτταρική σειρά Huh7.5, η μοναδική ως σήμερα που μπορεί να υποστηρίξει τον πλήρη κύκλο ζωής του HCV, καθώς και ιικά υπο-στελέχη που παρασκευάστηκαν με βάση την αλληλουχία των στελεχών HCV-2a και -3a, τα οποία παρουσιάζουν διακριτές διαφορές στη λειτουργία, στην κινητική αναδιπλασιασμού τους αλλά και στις επιπτώσεις τους στον κυτταρικό φαινότυπο. Για τη μελέτη του ρόλου των LSDs στην HCV μόλυνση πραγματοποιήθηκαν μολύνσεις με τον HCV σε συνθήκες υπερέκφρασης της κάθε μίας ξεχωριστά, καθώς και μείωσης της δράσης ή της έκφρασης της LSD1 με φαρμακολογικό αναστολέα δράσης, με RNA σίγηση και με έκφραση ελλειμματικής LSD1 αντίστοιχα. Όσον αφορά στην LSD2, φάνηκε πως η υπερέκφρασή της δεν είχε ιδιαίτερη επίδραση στην κινητική της μόλυνσης. Αντίθετα, διαπιστώθηκε πως ο ιικός αναδιπλασιασμός αυξάνεται σημαντικά κατά τη μείωση της LSD1, ενώ αντίθετα αναστέλλεται κατά την υπερέκφραση της, καταδεικνύοντας έναν αρνητικό ρόλο της LSD1 στην επιτυχή ιική μόλυνση. Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν και σε τριπλές συγκαλλιέργειες ηπατοκυττάρων με κύτταρα του ηπατικού κολποειδούς. Από την άλλη, παρακάμπτοντας το στάδιο της εισόδου των ιοσωματίων σε συνθήκες υπερέκφρασης της LSD1, μέσω απευθείας διαμόλυνσης με το HCV RNA, δεν παρατηρείται αναστολή του ιικού αναδιπλασιασμού. Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει πως η LSD1 εμπλέκεται στα πρώτα στάδια της εισόδου του HCV ιοσωματίου. Για τη διερεύνηση του μηχανισμού παρεμπόδισης της HCV μόλυνσης, μελετήθηκαν παράγοντες της εισόδου/ενδοκυττάρωσης, μεταξύ αυτών και η επαγόμενη από ιντερφερόνη διαμεμβρανική πρωτεΐνη 3 (interferon-induced transmembrane protein 3, IFITM3). Η πρωτεΐνη αυτή εντοπίζεται στη μεμβράνη των ενδοσωμάτων και των λυσοσωμάτων και συμμετέχει στην άμυνα έναντι ιών που ακολουθούν το μονοπάτι της ενδοκυττάρωσης, οδηγώντας τα νεοεισερχόμενα ιοσωμάτια προς αποικοδόμηση στα λυσοσώματα. Η αντιιική δράση της ενεργοποιείται μέσω απομεθυλίωσης του μονο-μεθυλιωμένου καταλοίπου Κ88 από την LSD1. Τα πειράματα που διεξήχθησαν στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής, έδειξαν πως η έκφραση της IFITM3 αυξήθηκε από την HCV-μόλυνση, ανεξάρτητα από τα επίπεδα της LSD1, αναδεικνύοντας το ρόλο της ως συστατικό άμυνας έναντι του HCV. Μάλιστα, κατά την υπερέκφραση της LSD1, τα επίπεδα IFITM3 παρέμειναν αυξημένα ακόμη και 24 ώρες μετά τη μόλυνση. Επιπλέον, στις ίδιες συνθήκες, τα επίπεδα της ανενεργής IFITM3 ήταν μειωμένα, ωστόσο κατά την υπερέκφραση της LSD1 ήταν σχεδόν μηδενικά, υποδηλώνοντας αυξημένη αντιιική δράση της IFITM3. Η εξάρτηση του κύκλου ζωής του HCV από την ύπαρξη ενδοκυτταρικών λιπιδίων είναι πλέον αρκετά τεκμηριωμένη και συγκεκριμένα, απαιτείται η τροποποίηση του λιπιδικού μεταβολισμού προς τη δημιουργία ενός ενδοκυτταρικού περιβάλλοντος πλούσιου σε λιπίδια, που υποστηρίζει την αντιγραφή, αυτοσυγκρότηση και έκκρισή του από το κύτταρο. Πειράματα χρώσης και μέτρησης των λιποσταγονιδίων έδειξε δραματική μείωση του αριθμού τους κατά την υπερέκφραση της LSD1, ακόμη και μετά την HCV μόλυνση, υποδηλώνοντας την πιθανή παρεμπόδιση της συγκρότησης ιοσωματίων. Αναφορικά με τους μετέπειτα κύκλους ιικής μόλυνσης, αποδείξαμε ότι ο HCV οδηγεί σε προοδευτική συσσώρευση και υπεργλυκοζυλίωση της πρωτεΐνης EMMPRIN στο κύτταρο, πιθανότατα μέσω της διαρκούς και κυματοειδούς ρύθμισης της LSD1 κατά τη μακρόχρονη μόλυνση, η οποία ευνοεί την υπεργλυκοζυλίωση της EMMPRIN. Ο λόγος υψηλά/χαμηλά γλυκοζυλιωμένης EMMPRIN είναι σχετικός με την επαγωγή των MMPs. Στην παρούσα μελέτη διαπιστώσαμε πως η παραγωγή διαλυτών MMPs αυξάνεται από τις LSD1 και EMMPRIN, επιβεβαιώνοντας την ύπαρξη ενός άξονα LSD1-EMMPRIN-MMPs που θα μπορούσε να ενισχυθεί από την HCV μόλυνση επάγοντας προ-μεταστατικές διεργασίες. Συνολικά, στην παρούσα διατριβή αποσαφηνίστηκε για πρώτη φορά ο ρόλος της LSD1 στην HCV μόλυνση και ταυτοποιήθηκαν μηχανισμοί που προσδίδουν ανασταλτικό, για την HCV μόλυνση, χαρακτήρα στην LSD1, σε δύο διαφορετικά στάδια του ιικού κύκλου. Τέλος, βρέθηκε ότι η LSD1 συμμετέχει μέσω της EMMPRIN στην ανάπτυξη ενός προ-μεταστατικού μηχανισμού, που ίσως επάγεται από τον HCV. Τα αποτελέσματα αυτά αποτελούν εφαλτήριο για τη λεπτομερέστερη μελέτη των μηχανισμών που συνδέουν την HCV μόλυνση με την εξέλιξη της χρόνιας ηπατικής νόσου και την επαγωγή και εξέλιξη ηπατοκαρκινογένεσης, καθώς και για τον εντοπισμό μονοπατιών-στόχων για την αποτελεσματικότερη πρόληψη και διαχείριση της HCV-επαγόμενης ηπατικής νόσου.